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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 巢式PCR
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by baby1987 at 2012-09-01 13:42:04
第一轮空白是因为PCR反应条件的关系，小片段没有竞争优势，或者温度不适合引物扩增。你做阴性对照的目的是什么？

什么是小片段没有竞争优势啊？退火温度，都是实验室总结出来的，应该没有什么问题。
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11楼2012-09-03 22:22:42
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baby1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by crystallynn at 2012-09-03 22:22:42
什么是小片段没有竞争优势啊？退火温度，都是实验室总结出来的，应该没有什么问题。...

就是第一轮PCR退火温度还有延伸时间，都不利于短片段扩增，第二轮短片段有扩增优势啊。你的实验条件怎么可以用实验室总结出来的，个人差异还是挺大的。
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加油。
12楼2012-09-03 23:16:22
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励热心的虫虫 2012-09-04 13:45:28
我以前做巢式PCR也遇见过这种问题，把所有东西换了也出现这种情况，可能有两个原因：
1 由于巢式PCR高灵敏度和高特异性，模板中稍微一点点的污染都会扩增出条带，这在加样过程中由于我们看不见的液体飞溅而导致这种污染，这种就是加样时小心又小心，最好是预混所有溶液后再加样，戴手套操作。
2 你的内引物设计不够合理，本身存在很多缺陷，就会莫名其妙扩增出相应条带，这种是很难用一般理论去解释的，只能做到进一步优化引物。
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crystallynn
13楼2012-09-04 11:26:57
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cxb-abc

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 很好的建议哦 2012-09-05 13:52:44
crystallynn: 金币+2, ★★★★★最佳答案 2012-09-17 22:50:54
个人认为不是引物的问题：
建议：1，重新换新的东西，包括DNA。
      2，第一轮和第二轮在不同操作环境下操作。
      3，每次操作前，先配体系，再稀释模板。
      4，过程中轻轻把枪头打到专用水盒中，以免污染空气。
      5，买专用枪头（里面加一层滤膜），加样不会污染枪腔。我一开始用2.5 effendof 枪5只，最后还是避免不了。你按照我说的试一试。祝好运
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14楼2012-09-04 17:41:46
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

建议第二轮退火温度升高一点，如果阴性对照还是有和目的条带同样大小的带，就都回收测序吧！
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持之以恒、永不放弃！
15楼2012-09-04 18:42:55
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

建议第二轮退火温度升高一点，如果阴性对照还是有和目的条带同样大小的带，就都回收测序吧！
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持之以恒、永不放弃！
16楼2012-09-04 19:00:15
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
13楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-04 11:26:57
我以前做巢式PCR也遇见过这种问题，把所有东西换了也出现这种情况，可能有两个原因：
1 由于巢式PCR高灵敏度和高特异性，模板中稍微一点点的污染都会扩增出条带，这在加样过程中由于我们看不见的液体飞溅而导致这种 ...

嗯好的，谢谢指教。
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17楼2012-09-05 21:22:05
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by cxb-abc at 2012-09-04 17:41:46
个人认为不是引物的问题：
建议：1，重新换新的东西，包括DNA。
      2，第一轮和第二轮在不同操作环境下操作。
      3，每次操作前，先配体系，再稀释模板。
      4，过程中轻轻把枪头打到专用水盒中，以免 ...

嗯谢谢。
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18楼2012-09-05 21:22:41
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crystallynn

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-04 19:00:15
建议第二轮退火温度升高一点，如果阴性对照还是有和目的条带同样大小的带，就都回收测序吧！

好的谢谢、
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19楼2012-09-05 21:23:04
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一休great

铁虫 (初入文坛)
前辈你好，我现在的实验中也出现了相同的问题。第一轮PCR的阴性对照没有条带，再以此为模板进行第二轮PCR时就有条带了，和目的条带一样。但是在第二轮时另外做的一个不加模板的空白对照就没有条带。请问，你最后是怎么解决这个问题的
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奋斗
20楼2014-03-04 20:53:46
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