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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 微生物菌种的复壮
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betty

金虫 (正式写手)

[交流] 微生物菌种的复壮

用甘油管保存的菌由于时间较长，且已经传代多次了，需要从甘油管里选出酶活较高的菌。经过平板涂布、划线分离挑出单菌落、种子和发酵培养基后竟然测不出酶活了，这过程中会出现什么问题呢？（甘油管的菌都是有酶活的）

这个实验已经跟同学重复几遍了，都没有结果。且平板上长出的单菌落形态基本相似，也从划线平板上挑出多株单菌落做多组实验，依然没有结果。


请各位高手指教这过程中有什么问题，如果有什么好的复壮方法也望不吝赐教！

[ Last edited by betty on 2012-8-24 at 18:49 ]
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1楼 2012-08-24 18:47:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

reallpf

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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betty: 金币+3, 甘油管的酶活倒是有的，就是里面的菌可能不够纯，所以用平板划线纯化，但是经过纯化的单菌落没酶活 2012-08-31 14:31:02
我的菌发酵前也都会进行活化，如果做大罐还有一级种子和二级种子。还没有碰到过酶活丢失的情况。稍弱倒是会存在。你活化的也没有酶活的话你看要不多活化几次？如果你的酶的底物能作为碳源或氮源的话，试试选择培养基活化看看，应该可以的。
另外你说过你的甘油管极影经过多次传代了，利用pcr检验一下你的目的基因是否丢失了。不过这个可能性很小，一般发酵用的宿主都是可以稳定遗传很多代的。
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15楼2012-08-31 14:26:39
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zhangxingc

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
betty: 金币+5, 你的做法有一定道理，谢谢回帖！ 2012-09-17 09:49:00
scelab: 金币+5, x谢谢热心交流~ :) 2012-09-17 12:40:28
楼主，针对这种情况我们也曾遇到过，庆幸的是你的菌还能活化起来。
我的做法可能不够严谨，但能解决一下问题。我将菌种直接在液体中活化，然后传菌2-3代，用第3或第4代活力较旺的菌再进行平板划线挑单菌。然后进行下一步试验。
多活化几代的目的是希望将长势较好的菌也就是活性较高的菌保留下来，通过传代培养，它们的数量会增多，活性表现得更完全。
不够严谨的说法是，可能这种挑选出来的菌会有部分改变，至于具体怎么改变，我也说不准。
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17楼2012-09-17 08:44:31
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普通回帖

841790061

银虫 (著名写手)
★ ★
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betty: 金币+1, 是不是菌株在活化时没长好？ 2012-08-25 12:30:03
我从菌中保藏中心买来的菌种复水后，在平板上都过了三四天一点现象也没有，不知道咋整的？

另外，针对你的问题，我不太懂。
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2楼2012-08-24 21:57:03
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
betty: 金币+1, 我们的菌一直都是经过种子、发酵两个阶段的，两种培养基的基本成分类似 2012-08-25 12:31:44
必须经历种子阶段吗？我的菌如果搞种子，再接种酶活力就很低了。
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3楼2012-08-25 00:04:01
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tapmun

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
betty: 金币+1 2012-08-25 12:35:38
我从菌种保藏中心买回来的菌，发酵之后也没活下来，不知道为何
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4楼2012-08-25 00:42:19
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215421160

金虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
betty: 金币+1, 谢谢啊，不过我们实验室没有这种做法，不知道能不能做成功 2012-08-25 12:34:24
接种易感宿主，然后再分离，这是我们在国外常用的方法
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5楼2012-08-25 02:41:12
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liurechen

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
betty: 金币+2, 甘油管直接划线一般长得不好啊，还有测出酶活后怎么挑出单菌落？从发酵培养基里挑吗？ 2012-08-25 12:37:49
我们一般这样做：甘油管划线分离并对单菌落做标记，单菌落分别接种发酵培养基，分别测酶活，挑出酶活最好的单菌落，放大。
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6楼2012-08-25 09:24:21
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liurechen

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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rainwander: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-26 08:32:25
betty: 金币+2, 你的回帖很详尽，谢谢！ 2012-08-26 10:10:24
引用回帖:
6楼: Originally posted by liurechen at 2012-08-25 09:24:21
我们一般这样做：甘油管划线分离并对单菌落做标记，单菌落分别接种发酵培养基，分别测酶活，挑出酶活最好的单菌落，放大。

在做发酵的厂家，菌种复壮工作是一种日常工作。
甘油管一般划线后长出的单菌落做标记单独做发酵测试测酶活和转化水平，平板暂时不能丢弃，然后把在发酵小试上表现好的单菌落再做放大，放大后在与生产上的菌种作对比，如果转化水平高于生产水平，则做进一步稳定性考察后作为生产菌种使用。
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7楼2012-08-25 22:37:01
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flashqd

铁虫 (正式写手)
★
betty: 金币+1, 可能是因为菌种衰退太严重了吧 2012-08-30 16:35:53
我也遇到过这样的情况，跟楼主一样抓狂啊
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8楼2012-08-26 10:40:46
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841790061

银虫 (著名写手)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by 841790061 at 2012-08-24 21:57:03
我从菌中保藏中心买来的菌种复水后，在平板上都过了三四天一点现象也没有，不知道咋整的？

另外，针对你的问题，我不太懂。

基本没有活化这个步骤，就在接种前将安瓿管从冰箱中取出室温下放置两个小时。
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9楼2012-08-30 16:32:57
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爱莫若月

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 841790061 at 2012-08-24 21:57:03
我从菌中保藏中心买来的菌种复水后，在平板上都过了三四天一点现象也没有，不知道咋整的？

另外，针对你的问题，我不太懂。

这是你买的菌有问题啊~或者是邮寄过程中天气热菌死了
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10楼2012-08-30 18:10:54
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with_nothing

金虫 (正式写手)
★ ★
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betty: 金币+1, 脲酶，有合适培养基的 2012-08-31 11:49:40
什么酶呢，我瞎想一下啊，有没有合适的选择培养基，或者某种条件 压力筛选。
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12楼2012-08-31 09:35:44
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shawcat

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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betty: 金币+3, 甘油管是有酶活的，但经纯化得到的单菌落没有酶活。培养基没有改变，测酶活的试剂也是新配制的 2012-08-31 13:00:19
菌种出现问题了吧，理论上不会没有酶活的啊，工程菌除外~~
有些酶是需要诱导的，是不是培养基改变了啊？
还有就是要考虑测酶活的试剂有木有问题，弄个阳性对照试试；
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14楼2012-08-31 12:37:49
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caoqingqing

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
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betty: 金币+3, 甘油管不是同一批，是不同的人保存的，可能时间长有点退化吧，测酶活的条件是一样的 2012-09-16 21:44:19
楼主能保证甘油管和正常甘油管是同一批吗？
现在测酶活的条件和酶活的条件是否相同？
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16楼2012-09-16 21:40:22
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jsszzq

新虫 (小有名气)
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betty: 金币+2, 谢谢回帖！ 2012-09-17 10:58:17
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhangxingc at 2012-09-17 08:44:31
楼主，针对这种情况我们也曾遇到过，庆幸的是你的菌还能活化起来。
我的做法可能不够严谨，但能解决一下问题。我将菌种直接在液体中活化，然后传菌2-3代，用第3或第4代活力较旺的菌再进行平板划线挑单菌。然后进行 ...

支持这种方法，甘油冻存管中的细菌就像一个大病初愈的病人，各项功能都比较差，必须给予大量的营养，充分吸收、滋养。细菌在营养液中比在营养琼脂斜面上易生长（对氧需求特别高的菌除外）。
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18楼2012-09-17 10:44:34
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178359193

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
17楼: Originally posted by zhangxingc at 2012-09-17 08:44:31
楼主，针对这种情况我们也曾遇到过，庆幸的是你的菌还能活化起来。
我的做法可能不够严谨，但能解决一下问题。我将菌种直接在液体中活化，然后传菌2-3代，用第3或第4代活力较旺的菌再进行平板划线挑单菌。然后进行 ...

我最近遇到的情况跟楼主有点不一样，我是把菌种从甘油管接种到种子培养基，然后取100ul种子培养液稀释涂布，挑单菌落接到种子培养基，其余的种子培养基离心做转化，这样是有活力的，而挑了单菌落的种子培养基离心做反应，40几个单菌落都没有活力，不知道这是怎么回事？
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19楼2013-09-27 16:20:26
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178359193

金虫 (初入文坛)
楼主，你的问题解决了吗？
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20楼2013-09-27 16:21:51
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85319748611楼
2012-08-30 18:35   回复  
betty: 金币+1 2012-08-31 11:48:56
I_Gabriel13楼
2012-08-31 09:48   回复  
betty: 金币+1 2012-08-31 11:48:51
zhangxingc21楼
2013-09-27 17:46   回复  
引用回帖:
19楼: Originally posted by 178359193 at 2013-09-27 16:20:26 我最近遇到的情况跟楼主有点不一样，我是把菌种从甘油管接种到种子培养基，然后取100ul种子培养液稀释涂布，挑单菌落接到种子培养基，其余的种子培养基离心做转化，这样是有活力的，而挑了单菌落的种子培养基离心做 ...

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