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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体的构建
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sd3824289

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-24 10:53:21
虫有啊  你们在胶回收之前的双酶切 质粒都加多少啊 反应体系是多少  急需 谢谢赐教...

反应体系：
质粒：5μL
E1   ：0.5μL
E2   ：0.5μL
buff ：1μL
dd水：3μL
共10μL
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
11楼2012-08-25 09:06:26
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-25 08:37:31
你的胶回收之前的双酶切 是怎么做的 酶切体系中质粒加多少啊...

一般就看你的质粒浓度，我喜欢多加质粒，这样浓度大，好连接，连接也就是一种布朗运动，是随机的浓度高碰撞到一起的可能性也高！
质粒53ul 酶1 2ul 酶2 2ul 10*buffer 6ul，这个是可以调节的！
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
12楼2012-08-25 21:23:24
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sky_fly

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-27 13:46:54
amisking: 回帖置顶 2012-08-28 19:33:48
转化转不出来应该从以下几个方面找原因：
1.感受态细胞是否有效，因此每次转化时都应该做阳性对照
2.酶切是否有效，一般先连T载体，然后酶切连表达载体是最有效的方法，但是成本也是最高的。如果直接酶切PCR产物的话，一定要加保护碱基，不然导致切不动，另外酶切时间不能过长，一般为三个小时，过长的话酶会有星活力的表现
3.连接比例是否合适，载体和基因的浓度太低或者太高都会影响连接效率，一般连接体系可以设置为20ul及以下，载体的量一般为60ng,基因的量控制在60ng-100ng之间
希望对你有帮助
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绝望越大，突破就越大
13楼2012-08-26 11:22:32
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-25 21:23:24
一般就看你的质粒浓度，我喜欢多加质粒，这样浓度大，好连接，连接也就是一种布朗运动，是随机的浓度高碰撞到一起的可能性也高！
质粒53ul 酶1 2ul 酶2 2ul 10*buffer 6ul，这个是可以调节的！...

你的质粒是试剂盒还是普通方法提的？质粒浓度大约多少ng，50多ul加这么点酶根本切不动，
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14楼2012-08-27 08:31:39
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abc老米

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
还要看看，你的抗性是否加对了。不对的话，也长不出菌来
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15楼2012-08-27 09:26:14
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by abc老米 at 2012-08-27 09:26:14
还要看看，你的抗性是否加对了。不对的话，也长不出菌来

没加错 这么低级的错误出了的话 会发现的
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16楼2012-08-27 12:17:21
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+1, 股交流 2012-08-27 13:47:26
从你的描述看，你的回收是没有问题的，浓度应该足够支持下一步实验。你的问题可能就在连接上，转化不长菌，可以从以下几方面逐一排除：感受态活性、连接体系及比例，甚至你的操作！！
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持之以恒、永不放弃！
17楼2012-08-27 13:02:15
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hutingting

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-24 10:53:21
虫有啊  你们在胶回收之前的双酶切 质粒都加多少啊 反应体系是多少  急需 谢谢赐教...

这个酶切时，酶的说明书上都有推荐体系，NEB的大多是50ul体系里，质粒量要〈2ug
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18楼2012-08-27 14:44:03
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-25 21:23:24
一般就看你的质粒浓度，我喜欢多加质粒，这样浓度大，好连接，连接也就是一种布朗运动，是随机的浓度高碰撞到一起的可能性也高！
质粒53ul 酶1 2ul 酶2 2ul 10*buffer 6ul，这个是可以调节的！...

你加53ul质粒 2ul的酶怎么可能切开？
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19楼2012-08-27 17:26:26
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-27 17:26:26
你加53ul质粒 2ul的酶怎么可能切开？...

完全可以，酶切的效率还是很高的，我一直用这个体系，连接效果也还不错！当然我用的是OMEGA的质粒提取试剂盒，最后用100ul的水溶解
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
20楼2012-08-27 18:47:41
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