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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体的构建
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
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20楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-27 18:47:41
完全可以，酶切的效率还是很高的，我一直用这个体系，连接效果也还不错！当然我用的是OMEGA的质粒提取试剂盒，最后用100ul的水溶解...

你胶回收时 用的是大梳吗 几块胶和一起
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21楼2012-08-28 08:24:17
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mgangle

铁杆木虫 (著名写手)

乐乐家族-----乐颠颠
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21楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-28 08:24:17
你胶回收时 用的是大梳吗 几块胶和一起...

我们一般用大梳子，把60ul的酶切产物回收。因为本身质粒浓度较大，因此不需要几块胶合一块。一块就够了
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麦兜麦兜~~~我要一碗鱼丸粗面。。对不起，么有鱼丸粗面。。那，我要鱼丸么有鱼丸那，我要粗面…………么有粗面那，我要鱼丸粗面……………………
22楼2012-08-28 10:44:40
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by mgangle at 2012-08-28 10:44:40
我们一般用大梳子，把60ul的酶切产物回收。因为本身质粒浓度较大，因此不需要几块胶合一块。一块就够了...

502976898 能加我一下吗 向您请教
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23楼2012-08-28 11:11:13
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yijunliu

银虫 (初入文坛)
★
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如果没有大片段切下来，我一般不做胶回收，直接用PCR产物纯化试剂盒纯化后直接酶连，效果还是不错
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24楼2012-08-28 14:16:04
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
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分子克隆实验指南中第一章方案17在质粒载体中进行定向克隆，这一章你可以参考一下。根据前人经验我进行了一部分修改，其中载体和片段的比例我用的是1:3--1：8， 连接反应的时间为室温0.5-1h。
多位前辈提的建议我觉得很有用，我试着总结一下，连接反应做不出来原因可能有：
1、酶切产物不完全，没有配对的粘末端；片段与载体比例不合适，不能有效结合
2、连接酶效率不行（这个应该不会成为主要原因，在有粘末端存在的情况下，仅需退火即可形成环状，进行转染后缺口会自行补好）
3、感受态效率不够，或者转化量不够，应该做对照
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25楼2012-08-28 16:02:07
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lxh502976898

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 三十不惑 at 2012-08-28 16:02:07
分子克隆实验指南中第一章方案17在质粒载体中进行定向克隆，这一章你可以参考一下。根据前人经验我进行了一部分修改，其中载体和片段的比例我用的是1:3--1：8， 连接反应的时间为室温0.5-1h。
多位前辈提的建议我觉 ...

酶切后 做电泳 如果两天带特别明显 就能算酶切完全吗 还是有别的方法可以衡量酶切是否完全？请指教
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26楼2012-08-28 17:41:31
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guojianhang

铁虫 (初入文坛)
★
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换一下感受态试试吧，有可能是感受态过期了，也有可能是质粒不能在这种感受态中存在，所以转进去就不行了。一般一个目的基因的连接，效率低的话也会有连上的。
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27楼2012-08-28 20:31:44
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
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26楼: Originally posted by lxh502976898 at 2012-08-28 17:41:31
酶切后 做电泳 如果两天带特别明显 就能算酶切完全吗 还是有别的方法可以衡量酶切是否完全？请指教...

我认为两条带如果很清晰，有且仅有两条，肯定是切干净了，当然这是在单个酶仅有一个酶切位点的情况下
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28楼2012-08-29 19:51:38
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三十不惑

铜虫 (小有名气)
★
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其实连接比例也是一个很重要的方面。我试过一些比例，包括1:0-1,1:1-10,1:10-~，发现他们的连接效率真的不一样，影响很大。(这比例说的不是质量比，而是摩尔比.)

[ Last edited by 三十不惑 on 2012-8-29 at 19:55 ]
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29楼2012-08-29 19:54:09
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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先进行PCR验证是否连接上，如果可以P出来，再进行酶切，具体体系的设计只有自己慢慢摸索了，不过一般情况下都可以一次性搞定的1
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
30楼2012-08-29 21:08:44
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