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刁寒冰

银虫 (小有名气)

[交流] 测序 已有4人参与

之前做的PCR产物送到上海英峻那边去测序，就是单一条带，750bp，然后测序结果是上游出现后双峰，而下游测通了，有点糊涂了！想问知道的大虾，咋回事呢？
  还有我另一个条带测序，得到序列后去NCBI-blast嗯，但还是没有结果，反向序列也试过，还是比对不出来呢？不知怎么回事呢？

[ Last edited by 刁寒冰 on 2012-8-22 at 15:07 ]
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1楼 2012-08-22 14:05:45
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jingdejun

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-08-23 15:53:25
测序的事情我不是很清楚，所以就回答你后面的问题。

你说比对没有结果，我估计是你选类别的时候选错了，比如做的是微生物却选择了与人类的基因比较。这样的话，肯定是没有结果的啊!

不知道是不是这个原因。不过假如不是新基因的话，应该就是这个原因没错了，也是我经常犯的错。

希望有点帮助。
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2楼2012-08-22 16:33:01
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jl860822

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流，七夕快乐 2012-08-23 15:53:40
后面的问题，楼上已经帮你解答了，我回答前面的吧，你的正向引物可能适合常规扩增，但是并不适合测序，因为测序对引物要求高点，然后你的反向引物测通的意思就是你的反向引物是可用的，你先比对一下，是不是你要的序列，它可能靠近引物的几十个bp不太准确
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3楼2012-08-23 08:38:55
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jl860822 at 2012-08-23 08:38:55
后面的问题，楼上已经帮你解答了，我回答前面的吧，你的正向引物可能适合常规扩增，但是并不适合测序，因为测序对引物要求高点，然后你的反向引物测通的意思就是你的反向引物是可用的，你先比对一下，是不是你要的序 ...

你的意思是说，我只用反向测出的序列对比的话，在确定一下，那没有正向的序列跟对比结果没有影响吗？
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4楼2012-08-23 10:49:17
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jingdejun at 2012-08-22 16:33:01
测序的事情我不是很清楚，所以就回答你后面的问题。

你说比对没有结果，我估计是你选类别的时候选错了，比如做的是微生物却选择了与人类的基因比较。这样的话，肯定是没有结果的啊!

不知道是不是这个原因。不 ...

我都试过了呢？类别也没选错呢？对比就是没有呢，不知哪出问题了？
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5楼2012-08-23 10:50:14
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 10:49:17
你的意思是说，我只用反向测出的序列对比的话，在确定一下，那没有正向的序列跟对比结果没有影响吗？...

你可以咨询一下测序公司，他那边可以通过Walking来达到测通目的的，这个肯定是可以测出来的
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6楼2012-08-23 12:09:36
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 10:50:14
我都试过了呢？类别也没选错呢？对比就是没有呢，不知哪出问题了？...

你可以试着做一下tblastX分析，就是用的核苷酸序列去检索蛋白质。
存在一个情况就是：很多核苷酸不一定相似，但能够检索出相似的蛋白质。物种之间存在密码子的偏爱
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7楼2012-08-23 12:22:33
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tiani_tan

金虫 (小有名气)
一般情况下，测序只能保证600左右的准确性，虽然说每个反应在800bp左右，但两端的序列一般都不太保准，可以选择测通试试
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8楼2012-08-23 12:24:07
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wittyjc

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
个人意见，你的序列里有特殊结构，比如较长的poly结构、发卡结构等，都会影响测序，有时甚至导致测序无法进行。
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9楼2012-08-23 13:51:27
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by jl860822 at 2012-08-23 12:09:36
你可以咨询一下测序公司，他那边可以通过Walking来达到测通目的的，这个肯定是可以测出来的...

嗯，只能再问一下了，但没有上游引物的话，也能通过Walking方法测通吗？
实在不行的话 重新设计引物，重新送样了
谢啦
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10楼2012-08-23 22:06:00
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