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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-23 15:49:06
楼主，提质粒之前每一步都要监测。
在连接之前，确保回收片段是成功的。
在转化之后，菌落PCR，用你的引物和通用引物，确保挑取的单菌落时正确的。如果都没有问题，提取质粒就按照试剂盒操作就OK了。
如果比值不对也没关系，可以用单、双酶切，然后把没有酶切的质粒一起跑个胶根据各个情况下分子量大小就清楚了。
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11楼2012-08-22 17:05:53
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-22 15:03:57
请问一下，你用的是多大的菌夜量离心的？加入P2溶液后，说明书是菌夜变清亮粘稠？真不知这个清亮是到什么程度呢？...

我们一般是过夜培养，前一天晚上6点左右摇上，第二天八点多开始提质粒 ，小提的质粒，一般用3-4毫升菌液，裂解菌液是完全浑浊的，加完P2之后，菌液会变的清亮，但不是无色透明的，只是不浑浊
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12楼2012-08-23 08:39:32
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by hutingting at 2012-08-23 08:39:32
我们一般是过夜培养，前一天晚上6点左右摇上，第二天八点多开始提质粒 ，小提的质粒，一般用3-4毫升菌液，裂解菌液是完全浑浊的，加完P2之后，菌液会变的清亮，但不是无色透明的，只是不浑浊...

我也是过夜培养细菌，加入P2溶液后，也是没有透明，只是比之前清亮了，那我就真搞不懂我是哪边出问题了呢？那你们一般提出质粒的浓度多少啊？A260/280怎样？用质粒直接跑胶吗？结果怎样？
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13楼2012-08-23 10:38:49
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-22 17:05:53
楼主，提质粒之前每一步都要监测。
在连接之前，确保回收片段是成功的。
在转化之后，菌落PCR，用你的引物和通用引物，确保挑取的单菌落时正确的。如果都没有问题，提取质粒就按照试剂盒操作就OK了。
如果比值不 ...

之前我一直都是按照试剂盒直接提的，但就是浓度太低了，没法进行后面的实验，还在找找原因呢？
试剂盒提取的质粒，一般跑胶多大分子量呢？有时候都是两条或三条带呢？
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14楼2012-08-23 10:40:53
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by huangguoqing at 2012-08-22 15:56:48
电泳鉴定的时候你是用核酸蛋白分析仪测的还是琼脂糖电泳？还有我想问一下，你的质粒有多大？...

我用的是琼脂糖电泳，用质粒直接加10Xloading buffer电泳吧？但一直都没提出来呢，所以跑胶都没结果呢，我也不确定质粒多大了
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15楼2012-08-23 10:45:45
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
14楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 10:40:53
之前我一直都是按照试剂盒直接提的，但就是浓度太低了，没法进行后面的实验，还在找找原因呢？
试剂盒提取的质粒，一般跑胶多大分子量呢？有时候都是两条或三条带呢？...

质粒跑胶2条三条带都是正常的，我们无法知道其高级结构的情况。质粒跑胶只是确定质粒是提出来了的以及其粗略浓度大小。用单双酶切同时鉴定结果会比较准确。
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16楼2012-08-23 21:37:40
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刁寒冰

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by chenguestc at 2012-08-23 21:37:40
质粒跑胶2条三条带都是正常的，我们无法知道其高级结构的情况。质粒跑胶只是确定质粒是提出来了的以及其粗略浓度大小。用单双酶切同时鉴定结果会比较准确。...

嗯 但有时候浓度太低的话 我跑胶的时候都没有条带的！
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17楼2012-08-23 21:59:22
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 21:59:22
嗯 但有时候浓度太低的话 我跑胶的时候都没有条带的！...

没有带是不可能的，只是带会弱一点。
如果看不到带说明没有提出来应该。
如果想要提取浓度高一些，将正确的克隆多培养几管，离心后，去上清，悬浮后，将悬浮液放一起后再加裂解液就行了。
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18楼2012-08-23 22:52:47
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hutingting

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 10:38:49
我也是过夜培养细菌，加入P2溶液后，也是没有透明，只是比之前清亮了，那我就真搞不懂我是哪边出问题了呢？那你们一般提出质粒的浓度多少啊？A260/280怎样？用质粒直接跑胶吗？结果怎样？...

我们一般提的质粒的浓度在200ng/ul左右，用50ul洗脱，A260/280一般都在1.8-2.1之间，一般取1ul质粒跑胶，有时候一条带，有时候两条带，这都正常
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19楼2012-08-24 08:41:13
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hutingting

银虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 刁寒冰 at 2012-08-23 10:38:49
我也是过夜培养细菌，加入P2溶液后，也是没有透明，只是比之前清亮了，那我就真搞不懂我是哪边出问题了呢？那你们一般提出质粒的浓度多少啊？A260/280怎样？用质粒直接跑胶吗？结果怎样？...

浓度一般是200ng/ul，50ul洗脱，260/280一般在1.8-2.1之间，电泳有时候一条带，有时候两条带，都正常，重要的是后面要做酶切验证质粒正确与否。
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20楼2012-08-24 08:43:26
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