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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
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czcpudai

铜虫 (正式写手)

[求助] 请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？ 已有3人参与

本人打算做荧光定量PCR，现在做了普通的rt-pcr，三种基因的大小为352bp，362bp，228bp，结果都扩增出来了，下一步打算做荧光定量RT-PCR，荧光染料为SYBR，请问是不是可以接着使用普通Rt-PCR中所使用的引物呢，还是重新设计引物，使其产物大小在50-150bp之间？？？求解答？？
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1楼 2012-08-21 15:12:27
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宇宙小妖怪

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

建议重新设计引物，而且楼主需要注意，如果后期的引物设计不合理，溶解曲线会出现双峰情况，溶解曲线就是为了区分样品是否有非特异性扩增和初始模板有无被污染的情况，我们实验室用BIOGHC -PCR检测了DNA,如果出现单一峰且峰值在Tm值位置出现，这就证明没有非特异性扩增，且初始模板没有被污染；如果出现多个峰，估计是有非特异性扩增了或者初始模板有被污染的情况
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22楼2019-02-18 10:35:32
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mutou1025

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:25
一般在100bp左右，重新设计引物。你的300多bp太大了。SYBR我记得程序变形退火时间 好像比普通PCR时间短。太大了会不会没有完全P出来啊
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2楼2012-08-22 13:25:33
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ywding0628

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-08-22 15:16:34
一般都在80-150bp之间，建议重新设计引物。如果是SOSO FAST（BIORAD）的mix， 退火延伸一共只有5s。
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性格埋下了人生的伏笔~
3楼2012-08-22 14:31:18
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助，七夕快乐 2012-08-23 15:55:31
228可以试试。
我做过80-400bp的，200多点有的引物还是可以的，但是片段太长PCR效率就有点低，并且有非特异PEAK, 我一般用60度退火，但是提高温度到65度，可以减少或者消除非特异PEAK.
具体条件不能完全根据报道，具体情况具体分析，不过个人觉得，100-200左右的就很好。如果你的228效果不好，可以试试重新设计引物把目标片段定于150bp左右。
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4楼2012-08-22 20:18:01
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