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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 包涵体蛋白纯化不溶解，怎麽办？
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实心小白菜

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流经验 2012-08-21 16:16:03
你好，我们实验室也长期苦于蛋白在包涵体里，你可以用上边说的6M或者8M尿素溶解之后透析，透析之后尿素浓度降低了就能过镍柱了，不过如果透析过程中析出，那你就惨了。。。。。低温诱导25度过夜诱导效果还可以，有一部分可以溶解，不过这个全看运气了。。。。。还有就是你用的感受态细胞，据说有一种什么东西缺陷的感受态细胞，但是我们没看见有卖的，你要是看见了告诉我哦。。。。。。。。还有就是，我们实验室因为需要表达的蛋白特别多而且特别大，建立了一个昆虫细胞的表达系统，基本都是可溶的，就是需要多装几个载体~~~~
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有啥不高兴的事儿，说出来大家乐呵乐呵~
11楼2012-08-20 15:08:08
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gelois

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-08-21 16:16:14
引用回帖:
10楼: Originally posted by 简单HE认真 at 2012-08-20 14:45:46
15度又到有点太低了吧，我们过夜通常是20-25度的.......

15度的话，因为一般摇床温度再低也不会低到15的，显示是15度，其实温度一般都是在18度左右的，那个时候细菌生长比较缓慢，蛋白折叠的也就会缓慢正确的多。你们用20-25，应该是也行的。
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12楼2012-08-20 15:32:09
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dongniaoxin

铁杆木虫 (正式写手)

响当当的木头

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加尿素溶解，在过柱前可以通过透析、稀释等方法降低尿素浓度
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没有梦就走，没有错就不向谁低头
13楼2012-08-21 09:50:44
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王礼鹏

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-08-22 15:11:01
在缓冲液中加点DTT或者是2%的巯基乙醇，包涵体可以用含Triton-100或者2M的盐酸胍的洗涤液清洗以除去脂类和膜蛋白等杂质，然后用6M盐酸胍溶解，其中可以加点SDS破坏蛋白内的疏水键，增加其溶解性。然后可以复性，盐酸胍4M-1.5M,不过复性的效率只有20%左右，看运气啦，呵呵。。。。。
建议你表达时用低温低速诱导，这样可以适当减少包涵体的形成。。。。祝实验顺利
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14楼2012-08-22 09:36:42
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jackenmickey

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
15楼2012-08-23 13:12:44
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siwuliang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

8M Urea，我做过一个包涵体怎么都不溶，后来重新摇大瓶，破碎离心后，立即8M尿素溶解包涵体，因为包涵体冷冻后溶解性会变很差。或者你直接用尿素重选菌体破碎。
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16楼2012-08-23 16:41:55
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daguo0648

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

小MM，6MGuaHCl和8MUrea都可以溶解包涵体，而且都是可以过His柱的，你是从哪里听说他俩不能上His柱呢？而且GuaHCl增溶效果更好，过柱效果也好，因为本身是高盐可以防止非特异性吸附。你的包涵体最好先用1%triton，50mMTris，50mMnaCl，pH8.0去超声洗涤一下包涵体，然后离心沉淀再用50mMTris，6MGuaHCl，1mMDTT（5mMβ-ME）搅拌增溶3h即可，直接上His柱就行。DTT可以选择性添加，而且浓度不能高，否则不能过his柱会把Ni还原掉。如果搅拌增溶不行可以试试超声，基本不会有哪种包涵体连超声都无法增溶的，祝你好运。
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小小爬虫
17楼2012-08-23 16:49:17
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指上阡陌

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼上的说法是对的，网上可以搜到处理包涵体的资料
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虚心学习
18楼2012-09-16 09:34:08
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爨乡主人

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以先把包涵体冷冻一下，不要完全结成冰，然后加入变性剂，旋窝震荡辅助，比直接加效果好得多。这是我要去吃饭了先放冷冻，回来再加变性剂发现的。
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19楼2014-06-15 11:58:26
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XMC-7

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

在加变性剂8M Urea之前，可以用少量纯水吹匀包涵体。
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能帮的帮，难事求助的心情咱也经历过
20楼2015-09-08 17:17:13
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