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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


[交流] 如何加A尾

我的目的片段在1400bp左右,用了重叠延伸进行PCR,PCR中用的是Primer star,已经P出了目的条带,现在要将其与T载体连接,但是总是加不上A尾。我们是PCR结束以后跑电泳然后进行胶回收又加的A尾,试过了水浴72°30min,PCR仪72°孵育30min,加A尾都不成功,哪位大侠知道是什么原因或者有没有更好的加A尾的体系
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)


引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-29 09:32:50
那具体的体系是什么呢?Taq酶,dNTP,Taq buffer要加多少呢?...

20μ的体系:10×buffer 2μ,Taq 0.1μ,dNTP 2μ,剩下的就是模板了。我一般是这个体系。虽然产物不回收也能顺利加A,但是感觉还是回收后加A比较,毕竟不回收还残存部分未利用的引物,在Taq的作用下,可能会产生突变点。
9楼2012-07-29 16:33:13
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robert-RBT

木虫 (小有名气)


★ ★ ★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-28 22:49:40
不用加A,直接用平端载体连接就可以。或者不回收,直接补加Tag DNA polymerase,72度10-30分钟就可以。
2楼2012-07-28 21:45:38
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-07-28 21:45:38
不用加A,直接用平端载体连接就可以。或者不回收,直接补加Tag DNA polymerase,72度10-30分钟就可以。

我们没有平末端载体,一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么?!
3楼2012-07-28 22:14:50
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robert-RBT

木虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-28 22:14:50
我们没有平末端载体,一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么?!...

没关系啊,最后经过切胶回收,即使有非特异性片段,也是少到可以忽略不计的程度。
4楼2012-07-28 23:43:49
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