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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何加A尾
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[交流] 如何加A尾

我的目的片段在1400bp左右，用了重叠延伸进行PCR，PCR中用的是Primer star，已经P出了目的条带，现在要将其与T载体连接，但是总是加不上A尾。我们是PCR结束以后跑电泳然后进行胶回收又加的A尾，试过了水浴72°30min，PCR仪72°孵育30min，加A尾都不成功，哪位大侠知道是什么原因或者有没有更好的加A尾的体系
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1楼 2012-07-28 21:18:00
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-29 09:32:50
那具体的体系是什么呢？Taq酶，dNTP，Taq buffer要加多少呢？...

20μ的体系：10×buffer 2μ，Taq 0.1μ，dNTP 2μ，剩下的就是模板了。我一般是这个体系。虽然产物不回收也能顺利加A，但是感觉还是回收后加A比较，毕竟不回收还残存部分未利用的引物，在Taq的作用下，可能会产生突变点。
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9楼2012-07-29 16:33:13
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-28 22:49:40
不用加A，直接用平端载体连接就可以。或者不回收，直接补加Tag DNA polymerase，72度10-30分钟就可以。
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2楼2012-07-28 21:45:38
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-07-28 21:45:38
不用加A，直接用平端载体连接就可以。或者不回收，直接补加Tag DNA polymerase，72度10-30分钟就可以。

我们没有平末端载体，一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么？！
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3楼2012-07-28 22:14:50
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-28 22:14:50
我们没有平末端载体，一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么？！...

没关系啊，最后经过切胶回收，即使有非特异性片段，也是少到可以忽略不计的程度。
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4楼2012-07-28 23:43:49
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