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飘零的叶子

新虫 (小有名气)

[交流] 如何加A尾

我的目的片段在1400bp左右，用了重叠延伸进行PCR，PCR中用的是Primer star，已经P出了目的条带，现在要将其与T载体连接，但是总是加不上A尾。我们是PCR结束以后跑电泳然后进行胶回收又加的A尾，试过了水浴72°30min，PCR仪72°孵育30min，加A尾都不成功，哪位大侠知道是什么原因或者有没有更好的加A尾的体系
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1楼 2012-07-28 21:18:00
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回帖置顶 ( 共有10个 )

robert-RBT

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-07-28 22:49:40
不用加A，直接用平端载体连接就可以。或者不回收，直接补加Tag DNA polymerase，72度10-30分钟就可以。
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2楼2012-07-28 21:45:38
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-07-28 21:45:38
不用加A，直接用平端载体连接就可以。或者不回收，直接补加Tag DNA polymerase，72度10-30分钟就可以。

我们没有平末端载体，一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么？！
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3楼2012-07-28 22:14:50
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-28 22:14:50
我们没有平末端载体，一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么？！...

没关系啊，最后经过切胶回收，即使有非特异性片段，也是少到可以忽略不计的程度。
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4楼2012-07-28 23:43:49
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robert-RBT

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-28 22:14:50
我们没有平末端载体，一直都是用T载体。如果PCR结束以后直接加Taq酶的话那非特异性扩增的片段不也加上A尾了么？！...

没关系，最后经切胶回收后，即使有非特异性片段，也是少到可以忽略不计的程度。
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5楼2012-07-28 23:45:41
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
我之前是不回收直接加Taq 72℃PCR仪15min，几次都成功。我一个同学是回收后不加引物，PCR 72℃10min，好像也是屡试不爽。
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6楼2012-07-29 09:28:47
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by joan198108 at 2012-07-29 09:28:47
我之前是不回收直接加Taq 72℃PCR仪15min，几次都成功。我一个同学是回收后不加引物，PCR 72℃10min，好像也是屡试不爽。

那具体的体系是什么呢？Taq酶，dNTP，Taq buffer要加多少呢？
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7楼2012-07-29 09:32:50
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云破月来xxz

银虫 (小有名气)
★
飘零的叶子(金币+1): 谢谢参与
你需要对过程进行分析，比如加入酶的量以及所需的离子浓度等等。还有就是你胶回收后得到的DNA片段是否是完整的，量是不是很多，乙醇残留量等等。总之，优化加尾之前的反应条件后，如果再不出来再考虑你的加A体系。还有，你的T载体，以及感受态之类的是否完好足以保证反应需求，也是你检验是否加了A尾的关键。
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8楼2012-07-29 11:51:59
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘零的叶子 at 2012-07-29 09:32:50
那具体的体系是什么呢？Taq酶，dNTP，Taq buffer要加多少呢？...

20μ的体系：10×buffer 2μ，Taq 0.1μ，dNTP 2μ，剩下的就是模板了。我一般是这个体系。虽然产物不回收也能顺利加A，但是感觉还是回收后加A比较，毕竟不回收还残存部分未利用的引物，在Taq的作用下，可能会产生突变点。
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9楼2012-07-29 16:33:13
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 云破月来xxz at 2012-07-29 11:51:59
你需要对过程进行分析，比如加入酶的量以及所需的离子浓度等等。还有就是你胶回收后得到的DNA片段是否是完整的，量是不是很多，乙醇残留量等等。总之，优化加尾之前的反应条件后，如果再不出来再考虑你的加A体系。还 ...

回收的DNA的量不是很多，因为电泳的条带不是特别的亮，片段是不是完整这要怎么看，得测序？不过电泳时条带位置是正确的，乙醇残留量我觉得是没问题，我们一般都会开盖晾半小时的
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10楼2012-07-30 09:09:25
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飘零的叶子

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by joan198108 at 2012-07-29 16:33:13
20μ的体系：10×buffer 2μ，Taq 0.1μ，dNTP 2μ，剩下的就是模板了。我一般是这个体系。虽然产物不回收也能顺利加A，但是感觉还是回收后加A比较，毕竟不回收还残存部分未利用的引物，在Taq的作用下，可能会产生 ...

这样啊，模版量这么多，酶会不会太少点啊？！
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11楼2012-07-30 09:44:19
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