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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 麻烦大家帮我分析分析，谢谢了！
汕头大学海洋科学接受调剂
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小头萝卜

铜虫 (小有名气)

[求助] 麻烦大家帮我分析分析，谢谢了！

我要做的是把一个6000多bp的片段连接到一个5000多bp的一个载体上。最后做了双酶切实验，切出了两条带，并且与marker（12000-500）相对照，大小正确，而且做了阴性对照。但是送去测序，结果显示是空载体。我想问一下，这是为什么呢？难道是目的片段丢失了？谢谢大家了！
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1楼 2012-07-24 08:38:05
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sd3824289

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小头萝卜: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-07-24 10:16:44
你也可以这样试一下，用单酶切把质粒切一下试试，两个酶分别切一下试试！我也遇到过这样的问题！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
2楼2012-07-24 09:15:38
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小头萝卜: 金币+1, ★有帮助 2012-07-24 10:18:19
你的目的片段是6000bp还是600bp呀，你是不是写错了，如果连接成功的话，想你的这种情况，就不用双酶切了，质粒跑胶就可以了。最好上图。
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coasttocoast。
3楼2012-07-24 09:47:27
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小头萝卜

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sd3824289 at 2012-07-24 09:15:38
你也可以这样试一下，用单酶切把质粒切一下试试，两个酶分别切一下试试！我也遇到过这样的问题！

好的，我再试试。谢谢了！
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4楼2012-07-24 10:16:32
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小头萝卜

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-24 09:47:27
你的目的片段是6000bp还是600bp呀，你是不是写错了，如果连接成功的话，想你的这种情况，就不用双酶切了，质粒跑胶就可以了。最好上图。

是6000bp，没有写错，目的片段是有些大。麻烦再问一下，为什么不用双酶切，直接跑胶就可以了？谢谢了。
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5楼2012-07-24 10:18:14
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tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
小头萝卜: 金币+1, ★有帮助 2012-07-24 10:57:52
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小头萝卜 at 2012-07-24 10:18:14
是6000bp，没有写错，目的片段是有些大。麻烦再问一下，为什么不用双酶切，直接跑胶就可以了？谢谢了。...

6000加5000都一万多了，跑胶还看不出来吗？如果不对的话，可能是你的载体上有你双酶切的酶切位点。
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coasttocoast。
6楼2012-07-24 10:37:00
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小头萝卜

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tupac225 at 2012-07-24 10:37:00
6000加5000都一万多了，跑胶还看不出来吗？如果不对的话，可能是你的载体上有你双酶切的酶切位点。...

嗯。我再跑个试试吧。谢谢了！
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7楼2012-07-24 10:57:37
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小头萝卜: 金币+2 2012-08-03 13:32:31
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小头萝卜 at 2012-07-24 10:18:14
是6000bp，没有写错，目的片段是有些大。麻烦再问一下，为什么不用双酶切，直接跑胶就可以了？谢谢了。...

我认为在你连接转化提质粒后，在做酶切验证的时候，对于你的情况，在做双酶切时，不仅要用连接时接头2个酶切位点，还要选一对片段中和载体上得2个酶切位点来做验证。另外，载体连入片段后，单酶切线性化也是一定要做的。
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8楼2012-07-24 15:04:16
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小头萝卜

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by reallpf at 2012-07-24 15:04:16
我认为在你连接转化提质粒后，在做酶切验证的时候，对于你的情况，在做双酶切时，不仅要用连接时接头2个酶切位点，还要选一对片段中和载体上得2个酶切位点来做验证。另外，载体连入片段后，单酶切线性化也是一定要 ...

嗯，谢谢了！单酶切线性化我一直都没做过，看来是得做做。谢谢你的建议。
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9楼2012-08-03 13:33:20
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jxm520zyc

木虫 (正式写手)
你的目的片段好大啊，即使你连上了，如果用常规测序的话，可能都测不出来，一般超过1000bp就好难测了~
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学习中~
10楼2012-08-04 14:06:31
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