24小时热门版块排行榜    

查看: 2237  |  回复: 16
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR相关问题

大神帮我!
目前在做心脏组织的逆转录PCR。遇到的问题,首先用trizol提取总RNA,测其吸光度比值260/280在1.5左右,远大不到1.8-2.0。有人说是因为我用DEC水稀释做空白,用TE会好些,暂时还没有实践。比值小于1.8应该是有蛋白污染吧?然后如果继续做下面的逆转录和扩增有什么影响呢?
    扩增时问题,内参表达不好(内参为gapdh)。并且阴性对照管也有表达!?ct值在25到28左右!这个问题是不是很严重?
    大神指导一下吧!
用的枪头,EP管都是直接购买的无酶的产品,有一段时间了。会不会应经被污染有RNA酶呢?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wfli.bees

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
RNA OD 260/280 1.5说明提取物不纯,蛋白残留严重,至于是用DEPC 水稀释还是TE稀释,我认为并不重要,我是用前者稀释的,完全没有问题。阴性对照ct值在25到28左右,我想比较大的可能是发生污染,这可以从融解曲线出峰位置可以明白,出峰位置如果与目的扩增片段位置一致则肯定是污染;建议使用新试剂,同时实验前后注意实验环境、器具清洁消毒。另外的可能是引物二聚体,也可从融解曲线判断出来,所以仔细研究溶解曲线很重要。祝实验顺利。
16楼2012-07-21 14:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 17 个回答

shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:11
RNA能不能用主要看电泳,有没有降解。OD值看的是纯度,不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右,得确定是不是扩增产物,还是引物二聚体?可以跑下电泳。
如果是产物的话,那就是污染了。
2楼2012-07-18 19:09:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

stewart3261

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-18 19:09:40
RNA能不能用主要看电泳,有没有降解。OD值看的是纯度,不纯的话可能会抑制PCR。
阴性对照ct值在25到28左右,得确定是不是扩增产物,还是引物二聚体?可以跑下电泳。
如果是产物的话,那就是污染了。

就是说,纯度不够会影响后面的扩增?
3楼2012-07-18 22:36:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tupac225

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-19 15:15:22
做荧光定量的pcr必须保证rna的完整性,提取rna时,所有的注意事项,都必须小心处理。不能图省事。提取rna用的所有东西,最好用depc水处理。祝你好运。
coasttocoast。
4楼2012-07-18 22:37:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 27/1350 2026-08-18 21:44 by Noways
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低?主要原因有哪些? +3 瞬息宇宙 2026-08-15 3/150 2026-08-18 21:40 by xiaohuixin
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 9/450 2026-08-18 20:09 by 奶牛小黑
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +51 医学老男孩 2026-08-13 110/5500 2026-08-18 19:07 by icerianxia
[基金申请] 明天放榜? +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[基金申请] 时间戳变了,能看出什么问题? +8 基诺咪客 2026-08-17 11/550 2026-08-18 17:13 by 悠然熊猫
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +9 yuleib84 2026-08-18 10/500 2026-08-18 16:52 by archvillain
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜? +13 Ldrop2023 2026-08-13 16/800 2026-08-18 12:25 by 淀粉搬运工
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +4 Tide man 2026-08-14 5/250 2026-08-18 11:35 by Tide man
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友,我要去昆明玩几天,回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 重要来源:本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了,巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
信息提示
请填处理意见