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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 2174bp大小的分子片段和PMD18T都连不上，各位帮忙想想办法哦
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水晶无影

新虫 (初入文坛)

[求助] 2174bp大小的分子片段和PMD18T都连不上，各位帮忙想想办法哦

本人在做枯草芽孢杆菌中的表达，目的基因大小为2174bp，为什么和T载体都连不上呢？各位帮忙分析下原因，非常感谢哦，都做半年了，一直没结果
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1楼 2012-07-05 11:02:09
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-06 13:46:24
不知道你用的是什么T载体 如果是PMD19 T 那就不好连 因为载体大小和目的片段大小差不多 那就换个大的载体 如果不是这个载体那即是你目的基因浓度低了
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2楼2012-07-05 13:53:55
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水晶无影

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by syn1985 at 2012-07-05 13:53:55
不知道你用的是什么T载体 如果是PMD19 T 那就不好连 因为载体大小和目的片段大小差不多 那就换个大的载体 如果不是这个载体那即是你目的基因浓度低了

我用的是PMD18T，浓度还蛮大的，跑电泳颜色蛮深的。这个与引物有关系吗，因为我的引物不是自己设计的，是师姐帮忙设计的
，谢谢哦
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3楼2012-07-05 14:54:59
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maychao123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-06 13:46:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水晶无影 at 2012-07-05 14:54:59
我用的是PMD18T，浓度还蛮大的，跑电泳颜色蛮深的。这个与引物有关系吗，因为我的引物不是自己设计的，是师姐帮忙设计的
，谢谢哦...

跟引物没关系，只要PCR产物的大小正确就行，可能有关系的是你用的什么连接酶、连接体系、目的片段浓度，还有，是化转以后没有阳性重组子？还是以连接体系为模版去PCR就没有正切大小的条带呢？
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Don‘tforget3Oct
4楼2012-07-05 15:26:23
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-07-06 13:46:43
我的目的片段1926，连的pMD-19T，貌似连接也出问题了……
之前1790的片段很顺利的每次都能跟pMD19-T连接上.
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
5楼2012-07-05 15:30:09
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758836596

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-06 13:46:53
可能跟你PCR用的MIX有关系，有些mix的PCR产物直接就连上了，有些就不行，我们用的达科为的一种长链mix，连接1h就得到很多阳性菌落，祝你实验顺利。
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6楼2012-07-05 16:17:47
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kaikal

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我想问下你是用什么酶扩增的，如果用KOD这种高保真酶扩你需要加A尾的！如果不是的话，我建议自己重新设计一对引物吧！
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加油！！！
7楼2012-07-06 09:31:57
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水晶无影 at 2012-07-05 14:54:59
我用的是PMD18T，浓度还蛮大的，跑电泳颜色蛮深的。这个与引物有关系吗，因为我的引物不是自己设计的，是师姐帮忙设计的
，谢谢哦...

换个大的T载体连接吧 换个就应该能连上了
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8楼2012-07-06 11:55:00
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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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换个大点的T载体吧。另外不同的聚合酶可能涉及到是否还需要加A尾
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9楼2012-07-07 14:07:31
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