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水晶无影

新虫 (初入文坛)

[求助] 2174bp大小的分子片段和PMD18T都连不上,各位帮忙想想办法哦

本人在做枯草芽孢杆菌中的表达,目的基因大小为2174bp,为什么和T载体都连不上呢?各位帮忙分析下原因,非常感谢哦,都做半年了,一直没结果
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758836596

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-06 13:46:53
可能跟你PCR用的MIX有关系,有些mix的PCR产物直接就连上了,有些就不行,我们用的达科为的一种长链mix,连接1h就得到很多阳性菌落,祝你实验顺利。
6楼2012-07-05 16:17:47
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syn1985

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-06 13:46:24
不知道你用的是什么T载体 如果是PMD19 T 那就不好连 因为载体大小和目的片段大小差不多 那就换个大的载体 如果不是这个载体那即是你目的基因浓度低了
2楼2012-07-05 13:53:55
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水晶无影

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by syn1985 at 2012-07-05 13:53:55
不知道你用的是什么T载体 如果是PMD19 T 那就不好连 因为载体大小和目的片段大小差不多 那就换个大的载体 如果不是这个载体那即是你目的基因浓度低了

我用的是PMD18T,浓度还蛮大的,跑电泳颜色蛮深的。这个与引物有关系吗,因为我的引物不是自己设计的,是师姐帮忙设计的
,谢谢哦
3楼2012-07-05 14:54:59
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maychao123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-06 13:46:35
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水晶无影 at 2012-07-05 14:54:59
我用的是PMD18T,浓度还蛮大的,跑电泳颜色蛮深的。这个与引物有关系吗,因为我的引物不是自己设计的,是师姐帮忙设计的
,谢谢哦...

跟引物没关系,只要PCR产物的大小正确就行,可能有关系的是你用的什么连接酶、连接体系、目的片段浓度,还有,是化转以后没有阳性重组子?还是以连接体系为模版去PCR就没有正切大小的条带呢?
Don‘tforget3Oct
4楼2012-07-05 15:26:23
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