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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+10, ★★★很有帮助, 西瓜哥就是给力啊!!! 2012-06-20 16:58:55
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 西瓜斑斑实在是太给力了 2012-06-20 17:22:16
我是只用Primer Premier 5(Primer 5)来设计,主要参考了Takara的试剂盒说明书上对于引物设计的要求(如图)。
其他就是普通PCR引物的要求了,而这些只要看引物设计软件的评分就可以了,评分越高越好。我自己用Primer Premier 5设计,大部分都是95分以上的才用。
如果是用Sybr Green,由于双链DNA都会引起荧光信号,所以尽量不要有错配、二聚体、发夹结构这些东西,在这里,这些比Tm值、GC含量还要重要些。实在免不了,那么其结合强度也不能高。可以看评分里面的AG值(如图),绝对值越大,结合强度越大。具体的我不是很清楚,只记得以前生物信息学上老师说过不能大于10。我自己有好几对引物的二聚体AG值在-6左右,用着倒是很正常。
另外,荧光定量PCR常用cDNA为模板来检测表达量,这种时候就需要避免基因组DNA的干扰。在引物设计上,有一些技巧可以避免基因组DNA得到扩增:1.让上下游引物中间隔着一个大的内含子,这样基因组DNA的产物由于太大,扩增效率很低。
2.让引物的5'端和3'在不同的外显子上,这样引物就不能结合到基因组DNA上啦。

以上就是本人在设计荧光定量PCR引物上的一些经验。引物到底好不好,最好还是要看荧光定量PCR的结果,看熔解曲线,如果只有单一的峰,说明产物很特异,引物可以用。





2楼2012-06-20 16:28:28
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