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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用Ecor1单切点，连接一片断，都是反向连接。疯掉了，求救求救
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蜗牛061610

木虫 (小有名气)

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[求助] 用Ecor1单切点，连接一片断，都是反向连接。疯掉了，求救求救

质粒10000bp，连接片段3400bp。
片段连接T载，质粒经过酶切后，直接CIAP去磷酸化1h后胶回收；
片段在T载上，也是酶切后回收。
刚开始长出的阳性菌有30个，只有1个为空载，其它全部连接上片段，用Pst1鉴定，正向连接可以切出900bp、2400bp、9600bp条带，反向连接可以切出2400、2600、8000条带。鉴定结果全为2400、2600和7000片段。后又重新制备材料，重新连接，共长出10个阳性菌，经过鉴定还是如此，没办法，又送去测序，测序结果显示也全部为反向连接。
求高人求救，连接了3周了，没挑出一个正向连接的，疯掉了快。
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1楼 2012-06-19 10:12:31
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