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蜗牛061610木虫 (小有名气)
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[求助]
用Ecor1单切点，连接一片断，都是反向连接。疯掉了，求救求救
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质粒10000bp，连接片段3400bp。 片段连接T载，质粒经过酶切后，直接CIAP去磷酸化1h后胶回收； 片段在T载上，也是酶切后回收。 刚开始长出的阳性菌有30个，只有1个为空载，其它全部连接上片段，用Pst1鉴定，正向连接可以切出900bp、2400bp、9600bp条带，反向连接可以切出2400、2600、8000条带。鉴定结果全为2400、2600和7000片段。后又重新制备材料，重新连接，共长出10个阳性菌，经过鉴定还是如此，没办法，又送去测序，测序结果显示也全部为反向连接。 求高人求救，连接了3周了，没挑出一个正向连接的，疯掉了快。  |
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