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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)

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[求助] 神经元细胞microRNA原位杂交已有1人参与

想在培养的神经元细胞上直接做microRNA原位杂交，现在已经从exiqon购买回地高辛双标的探针，如果对照下面的在组织切片上的操作流程，有哪些步骤是需要删减、增补或修改的？
1. 脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC-H2O各一次，每次5分钟。
2. 0.2M HCl室温处理5分钟。
3. PBS洗3次，每次5分钟。
4. 蛋白酶K（40μg/ml）室温孵育20分钟。
5. 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。
6. 4%多聚甲醛固定10分钟。
7. PBS洗2次，每次5分钟。
8. 醋酸酐和三乙醇胺溶液室温孵育10分钟。
9. PBS洗2次，每次5分钟；
10.57℃预杂交2小时。
11.57℃杂交4小时。（57℃：探针的杂交温度）
12.5×SSC洗2次，每次20分钟。
13.50%去离子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分钟。
14.TBST洗5次，每次5分钟。
15.室温封闭1小时。
16.抗地高辛一抗（1：500）4℃孵育过夜。
17.TBST洗4次，10分钟。
18.BCIP/NBT染色液缓冲液洗2次，每次10分钟。
19.BCIP/NBT暗处染色约2小时。
20.TE（pH8.0）洗两次终止反应.
21.水洗残液，脱水、封片。
有几个问题想询问一下：
(1)直接在种有神经元细胞的玻片上操作，应该不需要进行脱蜡和水化吧？那从哪一步切入比较合适，或是前面的步骤有什么是需要修改的？
(2)步骤2中HCl和步骤4中蛋白酶K的作用各是什么？
(3)在杂交之前，探针需要热变性不？变性温度是多少？
(4)TE终止反应，可以用别的溶液替代吗？
感谢大家耐心地看到最后，希望走过路过的能多多赐教！不胜感激啊！

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