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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 神经元细胞microRNA原位杂交
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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)

[求助] 神经元细胞microRNA原位杂交 已有1人参与

想在培养的神经元细胞上直接做microRNA原位杂交，现在已经从exiqon购买回地高辛双标的探针，如果对照下面的在组织切片上的操作流程，有哪些步骤是需要删减、增补或修改的？
1. 脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC-H2O各一次，每次5分钟。
2. 0.2M HCl室温处理5分钟。
3. PBS洗3次，每次5分钟。
4. 蛋白酶K（40μg/ml）室温孵育20分钟。
5. 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。
6. 4%多聚甲醛固定10分钟。
7. PBS洗2次，每次5分钟。
8. 醋酸酐和三乙醇胺溶液室温孵育10分钟。
9. PBS洗2次，每次5分钟；
10.57℃预杂交2小时。
11.57℃杂交4小时。（57℃：探针的杂交温度）
12.5×SSC洗2次，每次20分钟。
13.50%去离子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分钟。
14.TBST洗5次，每次5分钟。
15.室温封闭1小时。
16.抗地高辛一抗（1：500）4℃孵育过夜。
17.TBST洗4次，10分钟。
18.BCIP/NBT染色液缓冲液洗2次，每次10分钟。
19.BCIP/NBT暗处染色约2小时。
20.TE（pH8.0）洗两次终止反应.
21.水洗残液，脱水、封片。
有几个问题想询问一下：
(1)直接在种有神经元细胞的玻片上操作，应该不需要进行脱蜡和水化吧？那从哪一步切入比较合适，或是前面的步骤有什么是需要修改的？
(2)步骤2中HCl和步骤4中蛋白酶K的作用各是什么？
(3)在杂交之前，探针需要热变性不？变性温度是多少？
(4)TE终止反应，可以用别的溶液替代吗？
感谢大家耐心地看到最后，希望走过路过的能多多赐教！不胜感激啊！
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1楼 2012-06-15 17:06:19
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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kimlee at 2013-11-19 14:49:37
请问下细胞原位杂交样品如何处理啊，直接在波片上面固定吗？

恩，我是用多聚甲醛固定的。后续操作洗片的次数比较多，细胞还是比较容易脱落，所以固定还需要改进！
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6楼2013-11-20 09:27:51
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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xumandw at 2014-04-15 18:06:07
浓度是多少啊？不需要用TritonX100处理了吗？你现在有没有全部的步骤啊？  超级感谢啊...

蛋白酶K的工作浓度是5ug/ml，室温5min。没有再用TritonX100处理了。
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10楼2014-04-16 08:31:35
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wode0301

新虫 (初入文坛)
也要做这个，也很迷茫啊~~
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2楼2012-12-20 13:54:00
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默默c100

新虫 (初入文坛)
你好，请问miRNA原位杂交容易出结果不？我也想做这个，很迷茫啊。
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3楼2013-09-28 16:18:18
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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 默默c100 at 2013-09-28 16:18:18
你好，请问miRNA原位杂交容易出结果不？我也想做这个，很迷茫啊。

因为步骤比较多，容易出问题的地方比较多，所以要操作要小心。
个人认为：破膜和杂交的温度比较重要！
希望对你有用！
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4楼2013-09-29 08:33:42
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kimlee

新虫 (小有名气)
请问下细胞原位杂交样品如何处理啊，直接在波片上面固定吗？
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5楼2013-11-19 14:49:37
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xumandw

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-04-16 08:55:38
你现在有没有摸出好的方法来啊？我也在做这个细胞原位杂交，你还是用蛋白酶K处理吗？最后封片是怎么封的啊？
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7楼2014-04-14 20:51:27
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薄荷薰衣原

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xumandw at 2014-04-14 20:51:27
你现在有没有摸出好的方法来啊？我也在做这个细胞原位杂交，你还是用蛋白酶K处理吗？最后封片是怎么封的啊？

用了，用蛋白酶K处理，破膜效果好一些，探针更容易杂上。封片可以用50%甘油，或者再低一点浓度的，最后用透明指甲油封住盖玻片边缘。
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8楼2014-04-15 08:50:50
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xumandw

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 薄荷薰衣原 at 2014-04-15 08:50:50
用了，用蛋白酶K处理，破膜效果好一些，探针更容易杂上。封片可以用50%甘油，或者再低一点浓度的，最后用透明指甲油封住盖玻片边缘。...

浓度是多少啊？不需要用TritonX100处理了吗？你现在有没有全部的步骤啊？  超级感谢啊
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9楼2014-04-15 18:06:07
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