| 查看: 3541 | 回复: 13 | ||
[求助]
神经元细胞microRNA原位杂交 已有1人参与
|
||
|
想在培养的神经元细胞上直接做microRNA原位杂交，现在已经从exiqon购买回地高辛双标的探针，如果对照下面的在组织切片上的操作流程，有哪些步骤是需要删减、增补或修改的？ 1. 脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和DEPC-H2O各一次，每次5分钟。 2. 0.2M HCl室温处理5分钟。 3. PBS洗3次，每次5分钟。 4. 蛋白酶K（40μg/ml）室温孵育20分钟。 5. 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。 6. 4%多聚甲醛固定10分钟。 7. PBS洗2次，每次5分钟。 8. 醋酸酐和三乙醇胺溶液室温孵育10分钟。 9. PBS洗2次，每次5分钟； 10.57℃预杂交2小时。 11.57℃杂交4小时。（57℃：探针的杂交温度） 12.5×SSC洗2次，每次20分钟。 13.50%去离子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分钟。 14.TBST洗5次，每次5分钟。 15.室温封闭1小时。 16.抗地高辛一抗（1：500）4℃孵育过夜。 17.TBST洗4次，10分钟。 18.BCIP/NBT染色液缓冲液洗2次，每次10分钟。 19.BCIP/NBT暗处染色约2小时。 20.TE（pH8.0）洗两次终止反应. 21.水洗残液，脱水、封片。 有几个问题想询问一下： (1)直接在种有神经元细胞的玻片上操作，应该不需要进行脱蜡和水化吧？那从哪一步切入比较合适，或是前面的步骤有什么是需要修改的？ (2)步骤2中HCl和步骤4中蛋白酶K的作用各是什么？ (3)在杂交之前，探针需要热变性不？变性温度是多少？ (4)TE终止反应，可以用别的溶液替代吗？ 感谢大家耐心地看到最后，希望走过路过的能多多赐教！不胜感激啊！ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有261人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 细胞原位杂交样品处理？
已经有3人回复
6楼2013-11-20 09:27:51
10楼2014-04-16 08:31:35
2楼2012-12-20 13:54:00
3楼2013-09-28 16:18:18
4楼2013-09-29 08:33:42
5楼2013-11-19 14:49:37
xumandw
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1133
- 散金: 3
- 帖子: 39
- 在线: 24.1小时
- 虫号: 1223426
- 注册: 2011-03-06
- 性别: MM
- 专业: 神经生物学
7楼2014-04-14 20:51:27
8楼2014-04-15 08:50:50
xumandw
铜虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 1133
- 散金: 3
- 帖子: 39
- 在线: 24.1小时
- 虫号: 1223426
- 注册: 2011-03-06
- 性别: MM
- 专业: 神经生物学
9楼2014-04-15 18:06:07
20