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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么验证我转化成功呀
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清心莲子

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-14 13:35:00
我谈下我的血泪史，希望 对你有帮助。
1.连接问题。我是将我的目的基因从一个vector转到另一个vector.方法是用双酶切切下原质粒中的目的基因，跑胶严证后，胶回收。然后做ligation.
此时酶的活性切除率很重要。我的酶切率不高，因为连接好的质粒少。
2，转化后涂菌。我有空白组和质粒组。
2，验证，我小提质粒，做酶切确定和 测序。
幸好序列正确。酶切也正确。
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11楼2012-06-12 06:11:28
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kukusnoopy

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-14 13:35:12
1.首先最可能的原因是质粒没有完全切开，不知道你是单酶切还是双酶切，单酶切的话质粒容易自连，双酶切的话建议不要使用通用酶切buffer和条件去切，用分步酶切切得效果会比较好。
2.连接时质粒和目的基因的比例是否合适？
3.通常转化后平板长出来的菌P不出来或者双酶切没有目的条带，就说明你转进去的不是重组质粒，而是空载体。最先考虑的是第一条，你的质粒切开了没有。
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12楼2012-06-12 13:13:58
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yuer9809

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
挑的时候不久可以初步看出来了吗？转化成功的是白斑，没转进去的是蓝斑。不过有时候不明显那就把摇好的菌液提个质粒看呗。
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13楼2012-06-12 15:16:41
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mhmtf

铜虫 (小有名气)
★
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提质粒，质粒PCR，酶切验证，送菌株测序~
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gdfh
14楼2012-06-12 21:04:13
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
双酶切，送测
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15楼2012-06-13 21:18:11
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huichong

铁虫 (初入文坛)
谢谢各位了。我再说一下我做的吧，我是把我的质粒a做pcr加了个平末端，再把载体b做pcr加了平末端，然后做连接，再转化。现在一直是转化失败，我真无语了
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16楼2012-06-27 23:37:13
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陌笙石上菁

禁虫
★
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17楼2022-01-10 11:37:09
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