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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 怎么验证我转化成功呀
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huichong

铁虫 (初入文坛)

[交流] 怎么验证我转化成功呀 已有15人参与

我的质粒连接后就做了转化到DH5a里，然后涂在lb+氨苄的板子上也长了菌，但是我做菌液pcr验证的时候一直p不出来。没有条带，引物特别亮，究竟我这是不是没有转化成功呀，按道理不是长菌了就是成功了吗。
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1楼 2012-06-11 13:38:16
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kukusnoopy

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-06-14 13:35:12
1.首先最可能的原因是质粒没有完全切开，不知道你是单酶切还是双酶切，单酶切的话质粒容易自连，双酶切的话建议不要使用通用酶切buffer和条件去切，用分步酶切切得效果会比较好。
2.连接时质粒和目的基因的比例是否合适？
3.通常转化后平板长出来的菌P不出来或者双酶切没有目的条带，就说明你转进去的不是重组质粒，而是空载体。最先考虑的是第一条，你的质粒切开了没有。
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12楼2012-06-12 13:13:58
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黑手1989

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
长出来不代表转化进去了重组质粒，转进去空质粒的菌也是可以长出来的吧
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2楼2012-06-11 14:01:35
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流问题。 2012-06-11 20:32:54
本帖内容被屏蔽
3楼2012-06-11 15:32:37
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jiangly

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
amisking: 金币+2, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-06-11 20:32:58
你应该涂个空白对照，看看感受态有没有被污染或者平板的抗生素有没有失效。如果前两者没有问题，再做菌液PCR，还是你上述的结果的话，就是没有连接上，全是质粒自连了。
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4楼2012-06-11 15:51:45
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