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weiguo2889

木虫 (小有名气)

[求助] 大家帮我看看啊,我做的酶切反应到底是怎么回事呢?急急急!

这是我酶切的电泳图,用的是全基因组DNA,反应体系如下(体系是参考别人的):我想得到的是200-1000bp左右的片段         
            Genomic DNA            20μl (5-6μg)
            10×enzyme buffer    5μl (终浓度1×)
             Sau3AI                      2μl(10U/μl)
             ddH2O                       23μl         
             Total Volume        50μl
然后 37℃酶切2-3hr,结果就是这样了,这是我没纯化的总DNA做的,我纯化后做的更是一点条带都没有,到底是怎么回事啊?
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
首先,你的实验设计就不全面,只有MARKER和酶切后的图。最起码,要有原始的基因组DNA泳道,然后是酶切以后的泳道,这样才能看出来是否可以切开和酶切的效率。就目前的图看,你的基因组DNA基本上是降解了,否则不会那么低位置的条带,其次,应该有起码包含目的DNA的2条以上的片段出现;最后考虑是不是酶的纯度和反应体系的问题,建议用另一个已经鉴定过没有问题的基因组DNA做阳性对照,否则根本找不出问题在哪里。
14楼2012-06-09 22:05:35
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-07 22:52:43
DNA全都降解了。先确认一下是不是DNA本身已经降解,再看看内切酶或反应体系有没有问题。

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何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
2楼2012-06-07 11:52:07
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weiguo2889

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by hongqifei at 2012-06-07 11:52:07
DNA全都降解了。先确认一下是不是DNA本身已经降解,再看看内切酶或反应体系有没有问题。

但是我检测了提出的gDNA的啊,虽然有部分降解,但是还是有完整的,我觉得全部降解应该不是很可能吧,哎,这个反应体系是参考的别人博士论文里面的方法,内切酶也是在生工订的
3楼2012-06-07 12:04:51
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一申二心

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-08 13:51:14
你的这个结果好像是酶切出来。建议首先检测DNA,然后用不存在讲解问题的再做一下,还有在考虑是不是酶的添加量有问题

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4楼2012-06-07 14:04:42
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