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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR缓冲液（PCr Buffer）
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shiliu2011

木虫 (正式写手)

[交流] PCR缓冲液（PCr Buffer） 已有12人参与

从网上看到的，很不错，发到这里和大家一起学习咯！

用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。

　　1．Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。

　　样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。

　　dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2+的浓度。

　　2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。

　　3．KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。

　　4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。

　　5．二甲基亚砜（DMSO）　　在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。

       6．甘油：保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量

欢迎补充！

[ Last edited by shiliu2011 on 2012-6-4 at 19:41 ]
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1楼 2012-06-04 12:43:36
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q317476148

铁杆木虫 (著名写手)

喵星人
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
1．Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，此DNTP浓度正确吗？那么大？
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9楼2012-12-29 12:51:04
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guifang

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
感谢楼主分享，下次可以试着自己做一下，我现在都是买的
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2楼2012-06-05 08:57:17
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通缉要饭

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
好东西，顶起来，学习了，谢谢分享
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3楼2012-07-31 23:02:33
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shiliu2011

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 通缉要饭 at 2012-07-31 23:02:33
好东西，顶起来，学习了，谢谢分享

谢谢!相互学习!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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鎴戜滑鎬绘槸澶繃浜庡湪涔庝竴鏃剁殑寰楀け锛屽?村繕璁颁簡鎴?闀挎�?鏄渶閲?瑕?鐨�
4楼2012-08-02 01:13:35
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