| 查看: 4443 | 回复: 13 | |||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||||
shiliu2011木虫 (正式写手)
|
[交流]
PCR缓冲液（PCr Buffer）已有12人参与
|
||||||
从网上看到的，很不错，发到这里和大家一起学习咯！ 用于PCR的标准缓冲液见PCR操作范例。于72℃时，反应体系的pH值将下降1个单位，接近于7.2。二价阳离子的存在至关重要，影响PCR的特异性和产量。实验表明，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无任何作用。 1．Mg2+浓度Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，但并非对任何一种模板与引物的结合都是最佳的。首次使用靶序列和引物结合时，都要把Mg2+浓度调到最佳，其浓度变化范围为1～10mmol/L。Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。 样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。 dNTP含有磷酸根，其浓度变化将影响Mg2+的有效浓度。标准反应体系中4×dTNPs的总浓度为0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+浓度。因此，在高浓度DNA及dNTP条件时，必须相应调整Mg2+的浓度。 2．Tris -HCl缓冲液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl缓冲液，很少使用其他类型的缓冲液。Tris缓冲液是一种双极化的离子缓冲液，pKa为8.3(20℃),△pKa为0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)时，在典型的热循环条件下，真正的pH值在7.8～6.8之间。 3．KCl浓度K+浓度在50mmol/L 时能促进引物退火。但现在的研究表明，NaCl浓度在50mmol/L时，KCl浓度高于50mmol/L将会抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl对PCR结果没有太大影响。 4．明胶明胶和BSA或非离子型去垢剂具有稳定酶的作用。一般用量为100μg/ml，但现在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR结果，影响不大。 5．二甲基亚砜（DMSO） 在使用Klenow片段进行PCR时DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。 6．甘油：保护Taq酶，增加酶的稳定性，以提高产量   欢迎补充！ [ Last edited by shiliu2011 on 2012-6-4 at 19:41 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘贴专辑推荐
 分子生化实验经验积累 | PCR技术 | 基因工程、分子技术、微生物理论 | 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
球磨分散剂
已经有4人回复
-
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有64人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
-
韩国海关检测食用植物油中的苯并芘用的是哪种方法？
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 一种比较详细的PCR技术
已经有10人回复
- PCR标准体系有关问题。。求高手解答
已经有5人回复
- 【分享】【大全】看了一些PCR的资料，不知道这些有人用得上不
已经有45人回复
- 求助:TAKARA 10*PCR 缓冲液的配制!
已经有7人回复
- 求助:TAKARA 10*PCR 缓冲液的配制!
已经有6人回复
- 两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解
已经有18人回复
- PCR 总是呈现涂抹状 求解答！
已经有39人回复
- 做一个克隆所需的最短时间？比比谁更高效快速！
已经有39人回复
- PCR-SSCP 显色条带浅是什么原因？谢谢
已经有7人回复
- 【求助/交流】PCR 的原理是啥啊
已经有20人回复
- 【分享】荧光定量PCR实验指南（二）
已经有12人回复
- 【分享】PCR常见问题解决
已经有20人回复
- 【求助/交流】酵母菌落PCR
已经有12人回复
- 【求助/交流】PCR条带不清楚
已经有11人回复
谢谢分享，一起学习6楼2012-10-09 20:03:18
5