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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录前 DNA 酶消化
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)

[求助] 反转录前 DNA 酶消化

我克隆一段基因大约1800bp，先提取了RNA,RT-PCR测序后，发现含有内含子，可能是DNA污染了，打算用DNA酶消化一下，有没有哪位同学做过类似的实验，具体应该怎么做啊，消化后能不能RNA也降解了？请高手指点~

[ Last edited by fmtzhangli on 2012-5-31 at 11:43 ]
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1楼 2012-05-31 11:36:23
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Enchore

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一个基因的转录产物在不同的发育阶段、分化细胞核生理状态下，通过不同的拼接方式，可以得到不同的mRNA和翻译产物，成为选择性拼接，所产生的多个蛋白质即为同源体。选择性拼接的方式有4种：拼接产物缺失一个或几个外显子；拼接产物保留一个或几个内含子作为外显子的编码序列；外显子中存在5‘拼接点或3’拼接点，从而部分缺失该外显子；内含子中存在5‘或3’拼接点，从而使部分内含子变为编码序列。

以上内容是摘自高等教育出版社出版的《生物化学》第三版，王镜岩等人编写，p484 。
我最近也在做拿真菌里的一个基因做RT-PCR，两次测序结果都有内含子。。。 书上写的貌似存在这种情况，不晓得可不可以直接表达蛋白，会不会影响其功能
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11楼2013-05-13 13:33:29
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-31 13:47:01
加1～2ul 的RNase-free DNase，37度消化5～15分钟（根据你DNA的量的多少），时间不要太长，否则容易RNA也降解了。有条件可以过柱子回收RNA，或者用酚氯仿抽提2遍，基本也可以把蛋白去尽。
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2楼2012-05-31 11:55:39
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qdlinxiaofei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-31 17:13:27
我用的的是生工的试剂盒，不是很贵，很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂（40U/UL）37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次
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3楼2012-05-31 15:44:40
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qdlinxiaofei at 2012-05-31 15:44:40
我用的的是生工的试剂盒，不是很贵，很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂（40U/UL）37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次

这样做完是不是还要让DNA酶失活啊？怎么做呢？
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4楼2012-06-01 15:23:17
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