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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白是包涵体怎么溶
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by facingworld at 2012-05-23 14:45:07:
我做出来了，你不想告诉就不告诉，留着自己慢慢用

我少说了一句！公开的SCI文献有的是溶解包涵体的技术流程！你自己都不看！还好意思狂！？有本事是在包涵体复性。
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21楼2012-05-25 00:00:33
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
包涵体溶解还要低温！？溶解出来的蛋白质也是变性的，复性是下一步事情，低温只会降低反应速度！溶解就会用尿素！？就你这种水平，告你一种国外实验室多次成功使用并且在SCI文献公开发表的流程，你看还狂！好笑！！！
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22楼2012-05-25 00:04:42
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
你就这样干吧！别人坐波音767去纽约，你愿意坐牛车去随便呀！
我再如何生气，回答专业问题绝对是负责的，在二楼给你的实验流程也没有骗你，信不信随便。
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23楼2012-05-25 00:08:19
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 547star at 2012-05-23 16:21:45:
楼上面那位北大博士,让我想起那位发沈同笔记"上官婉儿"...

那时我还是北京大学的本科生。
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24楼2012-05-25 00:10:58
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
纠正一下：三楼的实验流程是国外实验室的，并且他们在SCI文献公开发表过，我本人做实验也用过其中一部分，证明是有效的。我再怎么生气也没有在试验流程上骗你或其他人，当然还有别的实验流程。
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25楼2012-05-25 00:15:35
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547star

木虫 (著名写手)
笔记做得好，印象比较深刻。
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为什么
26楼2012-05-25 02:15:41
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-05-22 20:51:51:
我没有具体操作？！那么北京大学的博士学位你说给的！！！！！！！！！？？？？？？？？？本来我今天还想给你多说几句！！！！！！！！！！！！你还挺狂！！！！！！！！！那你就狂吧！！！！！！！！！告诉你：变性

这位mm，你也不要太张扬了，博士学位博士不是资本，生物行业，做了就是王道，做的多就是王道，何况发了cns的不代表就比发了jbc的牛，
变性后层析，70%蛋白没有很满意的效果，你要是做了1000个蛋白，你就明白我说的，做多了，发现什么鸟都有，蛋白天生各异。




顺便回复，不能溶解很正常，有些包涵体就是不好溶解，

加以在8M尿素时候加100mM b-ME，或者10mMDTT，用高速匀浆器打散后室温静置半小时，


离心后把上清和沉淀都取样电泳看看，
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facingworld
27楼2012-05-25 06:48:15
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5, MolEPI+1, 应助指数+1, 鼓励交流~高人啊！ 2012-05-25 10:32:45
facingworld: 金币+12, ★★★★★最佳答案, 太有帮助了，真的是高人呀 2012-05-28 09:48:07
溶解包涵体没必要低温，温度越高越好，要是担心高温尿素分解的修饰影响，就加点tris进去，可以中和掉分解的尿素，包涵体溶解对ph 没多大要求

盐酸胍和尿素也没有根本的区别，但是是否加入还原剂有区别，

另外有极个别蛋白必须用sds溶解，sds基本可以搞定一切，溶解完全后用阴离子交换在尿素平衡条件下去掉sds，在柱子上调换变性剂，然后进行后续各种处理

当然首先你要跟踪包涵体是否还在，溶解之前电泳，溶解后上清和沉淀都要电泳，不建议用盐酸胍，因为这玩意处理了电泳麻烦，尤其是和尿素没有本质区别。

不过文献你也得看，自己脑子也的动动，生物这玩意玩的就是重复，玩的就是试探，玩的就是对照，设计好思路，不断试探，
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28楼2012-05-25 07:01:23
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
博士mm说得对，溶解是简单的一步，一般是很好搞的，除非极个别变态的，那是例外，

关键是后面的复性才是重点，


复性的方法各异，条件各异，谁更经抗，复性就看得出来，有的还没开始就挂了，有的可以走完全程，

复性得率是个大问题，稀释和透析是主流的复性方法，柱上复性是现在的paper最喜欢的，不过paper总讲特例，有一个大文章论述了这个问题，


如果你想复性更好，建议用skl，不过这玩意溶解性效果不敢恭维，

国内做结构的，清华，物理所，中科大有点，北大也有点？
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29楼2012-05-25 07:13:20
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
西瓜: , MM淡定哈 2012-05-25 10:33:51
引用回帖:
27楼: Originally posted by 皖山潜凤 at 2012-05-25 06:48:15:
这位mm，你也不要太张扬了，博士学位博士不是资本，生物行业，做了就是王道，做的多就是王道，何况发了cns的不代表就比发了jbc的牛，
变性后层析，70%蛋白没有很满意的效果，你要是做了1000个蛋白，你就明白我说的

你看清楚了，我在北京大学，不知在生物公司！另外，溶解包涵体很有成就吗？还有包涵体溶解居然低温这是正常的吗？！做得多怎么了，你怎么知道我实验做得少！？实验做得多与发表高水论文有关吗！？我什么觉得自己了不起了！？
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30楼2012-05-25 09:32:38
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