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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重组蛋白是包涵体怎么溶
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 皖山潜凤 at 2012-05-25 07:01:23:
溶解包涵体没必要低温，温度越高越好，要是担心高温尿素分解的修饰影响，就加点tris进去，可以中和掉分解的尿素，包涵体溶解对ph 没多大要求

盐酸胍和尿素也没有根本的区别，但是是否加入还原剂有区别，

另外

“溶解包涵体没必要低温，温度越高越好？”谁告诉你的呀！？你不怕实际发生副反应，发生分解，高温尿素分解的修饰影响，就加点tris进去就没有事情了？？
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31楼2012-05-25 09:34:44
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 皖山潜凤 at 2012-05-25 06:48:15:
这位mm，你也不要太张扬了，博士学位博士不是资本，生物行业，做了就是王道，做的多就是王道，何况发了cns的不代表就比发了jbc的牛，
变性后层析，70%蛋白没有很满意的效果，你要是做了1000个蛋白，你就明白我说的

“这位mm，你也不要太张扬了，博士学位博士不是资本，生物行业，做了就是王道，做的多就是王道，何况发了cns的不代表就比发了jbc的牛，
变性后层析，70%蛋白没有很满意的效果，你要是做了1000个蛋白，你就明白我说的，做多了，发现什么鸟都有，蛋白天生各异。”
什么叫“何况发了cns的不代表就比发了jbc的牛？？？”---------------你以为你是谁呀！！？？配如此评论？？？
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32楼2012-05-25 09:37:44
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
“当然首先你要跟踪包涵体是否还在，溶解之前电泳，溶解后上清和沉淀都要电泳，不建议用盐酸胍，因为这玩意处理了电泳麻烦，尤其是和尿素没有本质区别。”---------------
从蛋白质溶液里怎么盐酸胍？？透析、超滤不就行了！
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33楼2012-05-25 09:42:34
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
“这位mm，你也不要太张扬了，博士学位博士不是资本”----------我什么时候说过北京大学的博士学位是资本了，是楼主不看我说的流程，还说我我没有做实验，我才回击的！照你说的，那么么有博士学位就是资本了！？
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34楼2012-05-25 09:46:00
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
facingworld: 金币+4, ★★★★★最佳答案, 有条件的，我再试试哈！！谢啦~ 2012-05-28 09:55:29
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-28 15:51:56
扯远了.说下我看楼主帖子后想回复的。
我上次对没溶解的包涵体,清洗后,在8M尿素溶液（或其他胍盐变性溶液）中，用超声波破碎细胞的条件下处理了几分钟，结果大多数都溶解了，剩下一点，离心去除了。蛋白质跑SDSPAGE，目的带还是很亮的。
变性溶液下，超声波破碎处理包涵体，很快的就溶解出来了，有条件可以试试。
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为什么
35楼2012-05-25 09:57:16
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
另一个Protocol:
1.粉碎大肠杆菌，立新收集包涵体，加入0.01mmol/L PMSF（新鲜配制），50mmol/L(pH=8.0), 1mmol/L EDTA， 1mmol/LNaCl, 8mol/L,配成溶液，室温作用约1小时，过程中可用手轻轻摇匀，一般不用上摇床。
2.加入上述溶液的9倍体积的 50 mmol/L KH2PO4(pH=10)，1mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl, 室温约30-40分钟。第二步用NaOH将反应体系的pH调至10，配置缓冲溶液时即做到，如不行再做后调整。
3.用HCl 将溶液的pH调至约8.0，室温30分钟。
4.在4摄氏度下，10000-13000rpm 离心 15分钟或稍长时间，收集上清液和沉淀。
5.将上清液和沉淀于SDS-PAGE上样缓冲溶液混合，100 摄氏度煮沸5-10分钟，SDS-PAGE 电泳分析，观察溶解效果。

以上流程可以根据实际操作，适当修改，也用6mol/L盐酸胍对包涵体 进行溶解，电泳前用透析或超滤去除掉盐酸胍。

我不说出来实验流程，我就没有做过。。。那某人出生前，地球存在吗！？
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36楼2012-05-25 10:08:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
包涵体颗粒在溶解之前当然可以机械粉碎，再加变性剂溶解，这是因为增大了反应的表面积，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失，但是目前包涵体变性后复性收率达不到30%以上，机械粉碎包涵体颗粒肯定有额外损失完全可以通过增加反应速度和溶解率来加以补偿。

我说室温下反应也扯远了吗！！！？？？
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37楼2012-05-25 10:12:51
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
不吵了。。。我过去几天态度不好。是我不对。。。Sorry！
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38楼2012-05-25 10:43:56
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
不吵了。。。我过去几天态度不好。是我不对。。。Sorry！向楼主和楼上其他各位表示由衷的歉意！
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39楼2012-05-25 10:44:51
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匿名

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本帖仅楼主可见
40楼2012-05-28 09:53:36
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