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shipolande

新虫 (初入文坛)

[求助] 邻苯二酚1,2,邻苯二酚2,3双加氧酶基因扩增遇到大问题·········

本人最近做土壤中细菌邻苯二酚1,2,邻苯二酚2,3双加氧酶基因扩增,想PCR找出目的条带,可是做了好久了一直没有出现目的条带,心情十分郁闷,一直P不出来,模板是土壤总DNA,引物是文献上找的,条件也是参照文献的,就是抑制P不出条带,有哪位大侠做过的,给小弟一点点指点,本人就像做出点东西啊,可是自己知识面有限,经验又少,望大虾们给小弟点提示,在这感激不尽了啊······亲
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shipolande
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
先要用相应的底物富集下微生物吧?
相信自己
2楼2012-05-22 08:37:12
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shipolande

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by l68266152 at 2012-05-22 08:37:12:
先要用相应的底物富集下微生物吧?

可是以后做的实验也不是污染土壤,而是种植作物连作土······
shipolande
3楼2012-05-23 10:49:55
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by shipolande at 2012-05-23 10:49:55:
可是以后做的实验也不是污染土壤,而是种植作物连作土······

用高保守序列设计兼并引物,买用于扩增痕迹量模板的酶,多看看文献,我不认为能从无特异富集的土壤中扩增出这种酶。。。。
相信自己
4楼2012-05-23 18:40:46
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天鸟

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
对于功能基因从环境中扩增确实很多时候是扩增不出来的
这和你环境中的该基因的丰度有关,有些基因功能基因很好扩增,而且多样性也不错,如果你环境中该类基因很少的话,它的多样性也可能就是一两个OTU的,你如果你一定要做的话,一个是你可以重复扩增几次,一次不行,可以两次,三次。他们说的富集的方法确实可行的,但可能不是你当初设计试验的初衷。祝好
快乐生活,我快乐
5楼2012-05-24 08:56:32
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clx@6016

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先,通过富集液的方式,看看你的土样对芳香类化合物有没有邻苯二酚开环途径。
其次,根据文献,用多种引物进行扩增
最后,酶最好选用LA或者PFU
6楼2012-05-26 08:11:58
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