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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » western blot 背景深浅问题，请大家指教下啊
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nieyaru

新虫 (小有名气)

[求助] western blot 背景深浅问题，请大家指教下啊

我做的FN,Smad3还有IGFBP7三种抗体，一起做的为啥背景有的深有的浅？
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1楼 2012-05-18 00:35:19
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 专业又细心 2012-05-18 15:30:41
nieyaru: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-05-21 01:56:48
一抗和二抗浓度高时显色背景会深，而且过高的抗体浓度会引起非特异性背景条带的出现；封闭试剂的浓度时间和种类也会产生不同的背景；FN,Smad3还有IGFBP7三种抗体一起做的为啥背景有的深有的浅，与不同抗体御魔的结和力大小不同，抗体孵育后用同样的试剂洗膜，与膜非特异性结合的不同抗体的残留量不同，导致背景深浅不一。
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2楼2012-05-18 11:28:30
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nieyaru

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 凌波丽 at 2012-05-18 11:28:30:
一抗和二抗浓度高时显色背景会深，而且过高的抗体浓度会引起非特异性背景条带的出现；封闭试剂的浓度时间和种类也会产生不同的背景；FN,Smad3还有IGFBP7三种抗体一起做的为啥背景有的深有的浅，与不同抗体御魔的结 ...

可是我这是前面做过的人带着做的 ，她前面做的就很好，再做就不行了 很郁闷啊 试了很多次
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3楼2012-05-19 00:19:23
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-20 09:06:53
nieyaru: 金币+1, ★有帮助 2012-05-21 01:55:09
重复以后膜的条件本身也会发生变化，不一定能完全重复。我用质谱方法检测蛋白质-蛋白质相互作用，都是送学校检测中心，可是同样的蛋白质-蛋白质相互作用的实验操作，MS图谱重复性就是很难。用质谱方法能够检测蛋白质-蛋白质相互作用，参见：K.M.Downard, Mass Spectrometry of Protein Interactions,Wily-Interscience,2007.
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4楼2012-05-19 12:14:10
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flownaway

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
nieyaru: 金币+1, ★有帮助 2012-05-21 01:57:07
看一下抗体的说明书，上面应该有注明做Western Blot时抗体的效价，按照那个稀释抗体效果可能比较好
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5楼2012-05-19 22:51:21
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不同抗体的纯度不一样，导致的非特异性当然也不一样，就造成背景的不同
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6楼2013-03-07 07:51:53
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一抗和二抗的时间过长；抗体本身的质量问题；可以采用低背景的ECL发光试剂盒试试
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7楼2013-03-07 10:20:45
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