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jamy1989

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[求助] 透析后蛋白沉淀

我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析复性，透析完后全部沉淀了，跑胶什么都没有！我透析的步骤是：
1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
3、binding buffer 20mM磷酸钠 500mM氯化钠 5mM咪唑 PH=7.6
各位看看问题出在哪里呢？我每步在4度冰箱透析了24个小时！是不是我的蛋白浓度太大了呢？还是我透析的步骤太少！？或者其它什么原因？急呀？？？

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qwdr

1楼2012-04-23 09:34:22

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jamy1989

木虫 (小有名气)

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jamy1989: 回帖置顶 2012-04-29 09:29:11

引用回帖:

2楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-04-23 11:13:57:
我觉得你的浓度差拉太多了吧，中间在多增加几个梯度吧，不用每步都24h，在2-4M之间时间久一些就可，其余的6-12h可以的

这次透析的蛋白溶度被我降低了！并且每升只透析20ml，我做了个对比试验：
1号瓶分别用4M 尿素、 1M尿素、binding buffer 透析！
2号瓶分别用4M 尿素、 2M尿素、1M尿素、0M尿素、binding buffer 透析！
结果1号瓶还是在用binding buffer透析是全部出现沉淀，取沉淀跑胶，能看到目的条带！
2号瓶也是在用binding buffer 透析是全部出现沉淀（大约在透析3个小时的时候就有很多沉淀了），和1号瓶一样！另外当2号瓶透析到0M结束时我取了一些样保留下来，跑胶能看到目的条带！
我在想是不是binding buffer 有问题呢？我底下准备用His-tag纯化蛋白，是不是一定要用binding buffer 透析呢？