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水木丁

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 测抗体的紫外吸收时，266nm处有紫外吸收是什么物质的特征峰

1将5微升的抗体溶于500微升PBS（8.5）中， 37℃ 反应3h后 紫外吸收峰为A
2 将5微升的抗体溶于500微升的聚苯乙烯微球（PBS（8.5））中，37℃ 反应3h后 磁吸去除微球 留上清 测紫外吸收峰为B
理论上A应该大于B（280nm处  蛋白的吸收峰） B中的一部分抗体和微球连接 被 微球磁吸带走，但实验结果是 A在280nm处有很小的吸收（大约0.005左右）B在266nm处有很高的的紫外吸收（大约0.6左右）
    提要：聚苯乙烯微球是水相的  表面活化有羧基  会和 抗体表面的氨基反应
      问  1 ，266nm处是 什么的紫外吸收峰
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发现英语学习英语
1楼2012-04-12 15:24:22
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+4, Good！ 2012-04-12 23:57:35
水木丁: 金币+5, ★★★很有帮助, 感谢分析 但是 我的样品中没有核酸呀 只有抗体 是不是抗体的表面什么性质该变了 吸收向低波数移动？B中是抗体的吸收峰 那为什么A是同样的量时，，吸收怎么那么低？ 2012-04-13 08:52:44
.   A260nm
是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；
朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）
2.   A280nm
是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液
3.   A230nm
是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和 RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm
为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是 0。
5. A260/A280和A260/A230
是核酸纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在2.0 或2.5，A260 / A280的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是280 nm。 纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0 。A280是蛋白质的吸光度。
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2楼2012-04-12 22:08:01
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