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damaolehehe

木虫 (著名写手)

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[求助] HPLC流动相及其配比该如何选取？

对于一种文献中没有HPLC方法报道的化合物如何设置流动相，该遵循怎样的规律进行摸索和尝试？一头雾水啊，各位虫虫给讲讲啊~
而且用不同的流动相发现峰数和出峰位置相差很多怎么判断峰出没出全？
对于反相柱什么时候用甲醇-水什么时候用乙腈-水？
对于比例应该怎样的顺序去摸索？
从50:50往两端摸索还是从两端向中间摸索呢？

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心简单，世界就简单，幸福才会生长；心自由，生活就自由，到哪都有快乐

1楼 2012-03-29 17:02:13

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痴夷子皮

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老痞

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
soundhorizo: 金币+2, ACI+1, 果断给了~ 感谢应助 ^^ 2012-03-30 23:36:28
damaolehehe: 金币+3, ★★★★★最佳答案, 谢谢 2012-08-13 08:55:42

自己摸索条件。
a、样品性质
主要了解化合物的结构、分子量、pKa、UV、样品浓度范围、溶解度等。
b、色谱柱选择
样品能溶于水-有机混合液的大多数样品（特别是中性或非离子化合物），可以选择反相HPLC，流动相选择水-有机溶剂，色谱柱可以选择C18、C8、TMS、苯基、氰基。一般C18用得比较多。
样品为离子或可电离的化合物（特别是碱性或阳离子样品），可以选择离子对HPLC，流动相选择水-有机溶剂，控制pH的缓冲液和离子对试剂，色谱柱可选择C18、C8、氰基。一般C18用得比较多。
若反相或离子对HPLC无效时，或样品不溶于水-有机混合液。可以选择正相HPLC体系。流动相选择有机溶剂混合液，色谱柱选择氰基、氨基、硅胶、二醇基。
c、初始分离条件（相对较好的首要选择、等度）
色谱柱：150X4.6mm、5um、固定相为C18或C8
流动相：缓冲液-乙腈，缓冲液可选择纯水或缓冲盐（浓度10~30mM）（若中性样品，无需使用缓冲盐）并用酸碱调控pH（如果pH小于2.5，建议选择pH稳定的色谱柱，避免固定相流失），乙腈起始比例可以选择80~100%。
离子对等添加剂，开始时请不要使用。流速1.0~2.0ml/min，柱温35~40℃。
样品：（最好以流动相溶解样品）进样体积小于25uL，进样量小于100ug。
d、液相方法基本目标
分离度：R大于1.5
分离时间：5~10min较理想
定量：RSD小于2%
压力：基本要求小于200bar（20M）
针对基本目标，按实际情况进行调整，譬如流动相实际组分比例，缓冲盐浓度及pH，柱温，梯度等