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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 遇到大麻烦了，将一个3.1k的片段连入4.5k的载体，请教各位有没有什么好方法
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yabxxh

木虫 (正式写手)

[求助] 遇到大麻烦了，将一个3.1k的片段连入4.5k的载体，请教各位有没有什么好方法

如题，有没有人做过这样的试验，还请多多赐教。
    情况如下：
    片段K，大小3.1k，已经连接入T载体，并测序正确。
    载体A，大小4.7k，此载体为AAV载体（2型单链）pAAV-MCS，其最大装载容量4.7k，有国外文献报道可以装载5.2k的表达质粒。其说明书上说，最大插入片段为3k（按病毒包装上限，也就是两个ITR之间的序列）。我计算了一下，载体自身ITR之间的序列（包括CMV，beta globin intron和hGH pA）大小为1758bp，加上我的片段4815bp。
    更为严重的是，老板让两星期搞定，目前手头没有其他的载体，改造载体（替换短的终止序列）也不太现实。拿给公司去做，没有任何一个公司敢接。
    目前，我已经用紫外分光光度计定量了回收载体和片段，精确算出其摩尔数，考虑到是大片段连接，位阻效应比较严重，所以采用载体0.03pmol：片段0.3pmol的比例进行了12小时，24小时和48小时的连接、转化，结果只有24小时的有克隆，但是鉴定都为假阳性。
    感受态用的是全式金的九次方转化效率的T1，连接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0，阳性对照和阴性对照没有问题。
    下一步我打算用载体和片段的摩尔比梯度试一下。
    各位有什么好的建议，好的经验，或者有哪位仁兄做过类似的试验，还请多多赐教！
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1楼 2012-03-16 11:22:24
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yabxxh

木虫 (正式写手)
...，没有人吗
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2楼2012-03-16 13:33:03
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢提供思路 2012-03-17 22:25:44
别用通常的liagse-dependent cloning了，肯定不会好连的。用LIC吧
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2012-03-16 16:51:52
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 你是把7k的片段连到3.7k的载体？那我就有信心了！看样子只好做摩尔比梯度了 2012-03-17 22:30:27
我实验是7Kb连3.7kb，建议做好用16度过夜，4度25度都不好使
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4楼2012-03-17 19:50:51
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 做了七八年分子，以前都是估算的，后来发现还是仪器更准写，12,24,48都试了，还是不行，感谢提供思路 2012-03-17 22:28:54
（1）3.1K和4.5K连接不是很难。
（2）连接前的片段最好是电泳检测一下，和Marker比较一下亮度，可估算出大致的浓度。同时看一下片段是否是纯的，有没有杂带什么的。分光光度仪测的时候误差比较大。
（3）做连接反应，可以适当增加连接酶浓度，一般16度过夜即可。
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5楼2012-03-17 20:08:14
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yabxxh

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-03-16 16:51:52:
别用通常的liagse-dependent cloning了，肯定不会好连的。用LIC吧

LIC是什么，非依赖于连接酶的克隆？
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6楼2012-03-17 22:23:35
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yabxxh

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by brightfuture01 at 2012-03-16 16:51:52:
别用通常的liagse-dependent cloning了，肯定不会好连的。用LIC吧

请提供几种LIC的方法，谢谢！
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7楼2012-03-17 22:32:49
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

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telomerase: 金币+1, 谢谢你的热心应助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金币+50, ★★★很有帮助, 那篇文章我看了，貌似挺简单的，不过作为插入片段PCR的质粒模版好像要甲基化，我们平常的质粒提出来就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
引用回帖:
7楼: Originally posted by yabxxh at 2012-03-17 22:32:49:
请提供几种LIC的方法，谢谢！

下面这篇文章是最新发在BMC上的，看起来挺好用的。我还没有试过，你可以试试看：


FastCloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method

http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/92/

祝实验顺利
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
8楼2012-03-18 14:09:12
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小灰灰128

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, ...，你是5k连到3k的载体还是反过来啊 2012-03-20 11:08:30
学到很多，多谢了···········
我之前连过5K+3K的，没有用特殊办法就连上了，和普通的一样
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9楼2012-03-18 21:54:41
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bdpnx

铜虫 (小有名气)
找个合适的酶切位点，把3.1kb劈为2段，分步骤往上连，效率特别高。我每次就是这么干的，3k、4k、10k都可以成功。我做的载体最后17kb，我都顺利构建成功了。
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10楼2012-03-19 10:16:50
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