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yabxxh

木虫 (正式写手)

[求助] 遇到大麻烦了,将一个3.1k的片段连入4.5k的载体,请教各位有没有什么好方法

如题,有没有人做过这样的试验,还请多多赐教。
    情况如下:
    片段K,大小3.1k,已经连接入T载体,并测序正确。
    载体A,大小4.7k,此载体为AAV载体(2型单链)pAAV-MCS,其最大装载容量4.7k,有国外文献报道可以装载5.2k的表达质粒。其说明书上说,最大插入片段为3k(按病毒包装上限,也就是两个ITR之间的序列)。我计算了一下,载体自身ITR之间的序列(包括CMV,beta globin intron和hGH pA)大小为1758bp,加上我的片段4815bp。
    更为严重的是,老板让两星期搞定,目前手头没有其他的载体,改造载体(替换短的终止序列)也不太现实。拿给公司去做,没有任何一个公司敢接。
    目前,我已经用紫外分光光度计定量了回收载体和片段,精确算出其摩尔数,考虑到是大片段连接,位阻效应比较严重,所以采用载体0.03pmol:片段0.3pmol的比例进行了12小时,24小时和48小时的连接、转化,结果只有24小时的有克隆,但是鉴定都为假阳性。
    感受态用的是全式金的九次方转化效率的T1,连接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0,阳性对照和阴性对照没有问题。
    下一步我打算用载体和片段的摩尔比梯度试一下。
    各位有什么好的建议,好的经验,或者有哪位仁兄做过类似的试验,还请多多赐教!
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小灰灰128

金虫 (正式写手)

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感谢参与,应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, ...,你是5k连到3k的载体还是反过来啊 2012-03-20 11:08:30
学到很多,多谢了···········
我之前连过5K+3K的,没有用特殊办法就连上了,和普通的一样
9楼2012-03-18 21:54:41
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 谢谢提供思路 2012-03-17 22:25:44
别用通常的liagse-dependent cloning了,肯定不会好连的。用LIC吧
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2012-03-16 16:51:52
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cxl_yll

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 你是把7k的片段连到3.7k的载体?那我就有信心了!看样子只好做摩尔比梯度了 2012-03-17 22:30:27
我实验是7Kb连3.7kb,建议做好用16度过夜,4度25度都不好使
4楼2012-03-17 19:50:51
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muyanshuang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
yabxxh: 金币+20, ★★★很有帮助, 做了七八年分子,以前都是估算的,后来发现还是仪器更准写,12,24,48都试了,还是不行,感谢提供思路 2012-03-17 22:28:54
(1)3.1K和4.5K连接不是很难。
(2)连接前的片段最好是电泳检测一下,和Marker比较一下亮度,可估算出大致的浓度。同时看一下片段是否是纯的,有没有杂带什么的。分光光度仪测的时候误差比较大。
(3)做连接反应,可以适当增加连接酶浓度,一般16度过夜即可。
5楼2012-03-17 20:08:14
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