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yabxxh木虫 (正式写手)
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[求助]
遇到大麻烦了，将一个3.1k的片段连入4.5k的载体，请教各位有没有什么好方法
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如题，有没有人做过这样的试验，还请多多赐教。 情况如下： 片段K，大小3.1k，已经连接入T载体，并测序正确。 载体A，大小4.7k，此载体为AAV载体（2型单链）pAAV-MCS，其最大装载容量4.7k，有国外文献报道可以装载5.2k的表达质粒。其说明书上说，最大插入片段为3k（按病毒包装上限，也就是两个ITR之间的序列）。我计算了一下，载体自身ITR之间的序列（包括CMV，beta globin intron和hGH pA）大小为1758bp，加上我的片段4815bp。 更为严重的是，老板让两星期搞定，目前手头没有其他的载体，改造载体（替换短的终止序列）也不太现实。拿给公司去做，没有任何一个公司敢接。 目前，我已经用紫外分光光度计定量了回收载体和片段，精确算出其摩尔数，考虑到是大片段连接，位阻效应比较严重，所以采用载体0.03pmol：片段0.3pmol的比例进行了12小时，24小时和48小时的连接、转化，结果只有24小时的有克隆，但是鉴定都为假阳性。 感受态用的是全式金的九次方转化效率的T1，连接酶是TAKARA的Ligation Kit2.0，阳性对照和阴性对照没有问题。 下一步我打算用载体和片段的摩尔比梯度试一下。 各位有什么好的建议，好的经验，或者有哪位仁兄做过类似的试验，还请多多赐教！  |
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brightfuture01
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3楼2012-03-16 16:51:52
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【答案】应助回帖
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telomerase: 金币+1, 谢谢你的热心应助 2012-03-19 11:12:18
yabxxh: 金币+50, ★★★很有帮助, 那篇文章我看了，貌似挺简单的，不过作为插入片段PCR的质粒模版好像要甲基化，我们平常的质粒提出来就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
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yabxxh: 金币+50, ★★★很有帮助, 那篇文章我看了，貌似挺简单的，不过作为插入片段PCR的质粒模版好像要甲基化，我们平常的质粒提出来就是甲基化的吧 2012-03-20 11:07:30
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下面这篇文章是最新发在BMC上的，看起来挺好用的。我还没有试过，你可以试试看： FastCloning: a highly simplified, purification-free, sequence- and ligation-independent PCR cloning method http://www.biomedcentral.com/1472-6750/11/92/ 祝实验顺利 |
8楼2012-03-18 14:09:12