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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Western Blot 显影时PGDF膜上全是荧光，求解，有没有懂的呀
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安医小枫

新虫 (初入文坛)

[求助] Western Blot 显影时PGDF膜上全是荧光，求解，有没有懂的呀

Western Blot 显影时PGDF膜上全是荧光，做了好几次都是一样，不知道什么原因，哪位大神指点一下呀！
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1楼 2012-03-14 17:10:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
安医小枫: 金币+2, ★★★很有帮助, 封闭我是3小时，不知道你们做的时候是多长时间？ 2012-03-15 18:31:48
我想到的可能原因有两个：
1. 转膜后你的封闭是不是有问题，你是怎么封闭的啊
2. 一抗，二抗的特异性是不是不好。
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2楼2012-03-15 08:32:07
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shaquila

金虫 (正式写手)
楼主把tween浓度提高到0。2或0。4试试吧，多洗几次显色把
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10楼2012-03-17 00:29:22
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普通回帖

Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-03-15 08:32:07:
我想到的可能原因有两个：
1. 转膜后你的封闭是不是有问题，你是怎么封闭的啊
2. 一抗，二抗的特异性是不是不好。

支持楼上的。封闭出问题的可能性更大
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3楼2012-03-15 09:15:08
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ken126

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人估计：抗体特异性较差，发色液强度较高；
楼主可以将一抗及二抗浓度适当降低，另外可以试试强度较小的发色液。
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4楼2012-03-15 13:09:46
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果抗体就你一个人用，抗体的因素可以考虑，如果实验室里面别人用着很好，那就是操作问题了
重新封闭，延长封闭时间
降低抗体浓度
发色时降低浓度
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5楼2012-03-15 15:19:29
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安医小枫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-03-15 08:32:07:
我想到的可能原因有两个：
1. 转膜后你的封闭是不是有问题，你是怎么封闭的啊
2. 一抗，二抗的特异性是不是不好。

封闭是用5%牛奶，时间是3个小时，够长了吧！一抗、二抗没问题，第一次出来了，结果重复就不行了，做了3次都一样！求解呀！
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6楼2012-03-15 18:00:22
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xiaoqi5992

银虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 安医小枫 at 2012-03-15 18:00:22:
封闭是用5%牛奶，时间是3个小时，够长了吧！一抗、二抗没问题，第一次出来了，结果重复就不行了，做了3次都一样！求解呀！

是在室温下吗，要是在室温下的话，你把脱脂奶浓度提高到10%试试呢。
还有你第一次出来的是什么情况，一点背景也没有吗？
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7楼2012-03-16 08:22:44
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安医小枫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-03-16 08:22:44:
是在室温下吗，要是在室温下的话，你把脱脂奶浓度提高到10%试试呢。
还有你第一次出来的是什么情况，一点背景也没有吗？

是在室温下，第一次中间部分有些背景，但不强，能很清楚看到荧光条带。后来就不行了。
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8楼2012-03-16 20:31:43
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安医小枫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaoqi5992 at 2012-03-16 08:22:44:
是在室温下吗，要是在室温下的话，你把脱脂奶浓度提高到10%试试呢。
还有你第一次出来的是什么情况，一点背景也没有吗？

请问一下，脱脂奶粉提高到10%，是封闭时提高还是孵二抗的时候提高呢，或者都用10%的，谢谢啦
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9楼2012-03-16 20:38:17
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