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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR程序设置
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1397717

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR程序设置

现在在做一个PCR扩增实验，引物和DNA都有，请问如何设置PCR程序？
     Tm值在引物设计的时候已经确定了，扩增片段大小分别为431bp和671bp，那延伸时间和循环次数如何确定？ 谢谢！

[ Last edited by 1397717 on 2012-3-5 at 14:26 ]
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1楼2012-03-05 14:22:53
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thestormcong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以采用降落pcr，你可以去了解一下其原理，有助于增强特异性。
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13楼2012-03-06 10:00:25
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chubing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
普通pcr一般延伸时间是1imin.30-35个循环。
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2楼2012-03-05 14:44:58
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ZOEY21

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:57:52
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 10:58:58
即使你设计引物时确定了Tm值，正式试验时还是要摸索，这很重要。一般比引物合成报告单给出的低5度。建议你还是做个退火温度的梯度试验摸索下。
延伸时间和循环数个人觉得不是影响PCR的关键。你可以参照前人做的类似物种采取的反应程序。过多容易产生非特异带，过少产物不足。
一点拙见，不对地方请指正。
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3楼2012-03-05 14:56:44
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纸船

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:58:02
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:58:19
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:59:24
退火温度跟理论Tm值是有差别的，建议做下梯度PCR，你这么长的片段，延伸30S足够了，循环次数建议30-35.
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4楼2012-03-05 15:11:46
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