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质粒构建
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作为实验新手，近期要构建质粒，有些问题要向各位高手请教。 1、pcr产物和载体的酶切体系怎么确定，有什么需要注意的。是不是环状载体比线性片段难切。 2、目的片段和载体双酶切后连接体系的确定，目的片段和载体的摩尔比多少为好。每次连接时是不是都要测两者的浓度，根据公式再计算出两者的用量。连接时有什么需要注意的。我用T4连接酶。 3、构建质粒有一系列的工作，各位在各个步骤中有什么特别需注意的。 |
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xiazhiwuxie
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xiazhiwuxie
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【答案】应助回帖
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小丹木木(金币+2): 鼓励应助，很热心哦 2012-03-04 15:37:55
wcx蜗牛(金币+3): ★★★很有帮助 2012-03-07 09:54:27
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1.酶切体系，你可以参照限制性内切酶的说明书，我一般都是载体30ul, 两种酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性内切酶可能buffer也不一样。我都是环状质粒切的，效果还不错。我是设计带有限制性内切酶位点的引物去扩增目的基因，然后把这个基因连接到T载体上，然后再酶切的。 2 目的片段和载体的连接中比例大约为3/1左右。 3 构建质粒时最重要的是要保证你的感受态是OK的，两种质粒酶切3-6小时候，直接去跑胶，回收，立即连接。放置4度冰箱过夜，第二天下午转化，涂板。 这个板的筛选压力设置得小点，挑斑时多挑一些。 |
4楼2012-03-04 14:12:39