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质粒构建
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作为实验新手，近期要构建质粒，有些问题要向各位高手请教。 1、pcr产物和载体的酶切体系怎么确定，有什么需要注意的。是不是环状载体比线性片段难切。 2、目的片段和载体双酶切后连接体系的确定，目的片段和载体的摩尔比多少为好。每次连接时是不是都要测两者的浓度，根据公式再计算出两者的用量。连接时有什么需要注意的。我用T4连接酶。 3、构建质粒有一系列的工作，各位在各个步骤中有什么特别需注意的。 |
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2楼2012-03-03 15:23:37
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xiazhiwuxie
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1.酶切体系，你可以参照限制性内切酶的说明书，我一般都是载体30ul, 两种酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性内切酶可能buffer也不一样。我都是环状质粒切的，效果还不错。我是设计带有限制性内切酶位点的引物去扩增目的基因，然后把这个基因连接到T载体上，然后再酶切的。 2 目的片段和载体的连接中比例大约为3/1左右。 3 构建质粒时最重要的是要保证你的感受态是OK的，两种质粒酶切3-6小时候，直接去跑胶，回收，立即连接。放置4度冰箱过夜，第二天下午转化，涂板。 这个板的筛选压力设置得小点，挑斑时多挑一些。 |
4楼2012-03-04 14:12:39
5楼2012-03-07 09:57:33
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6楼2012-03-07 10:43:14
xiazhiwuxie
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7楼2012-03-07 13:33:53
【答案】应助回帖
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gs目的基因与p PIC9K质粒载体双酶切 EcoRI和NotI双酶切长度1400左右的目的基因体系： 10×H Buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl 0.1% TritonX-100 2 μl EcoRI和NotI DNA ≤1 μg 灭菌水 up to 20 μl 双切pic9K质粒 10×H Buffer 2 μl 0.1% BSA 2 μl 0.1% TritonX-100 2 μl EcoRI和NotI 质粒 ≤1 μg 灭菌水 up to 20 μl 37℃ 1hr （宝生物） 酶切后取电泳检测，并浓缩回收 2. T4连接酶连反应 10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μl DNA 片段 约 0.3 pmol 载体 DNA 约 0.03 pmol T4 DNA Ligase 1 μl dH2O up to 25 μl 16℃过夜反应 |
8楼2012-03-07 18:49:32
9楼2012-03-07 18:50:17
