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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)

[求助] 质粒构建

作为实验新手，近期要构建质粒，有些问题要向各位高手请教。
1、pcr产物和载体的酶切体系怎么确定，有什么需要注意的。是不是环状载体比线性片段难切。
2、目的片段和载体双酶切后连接体系的确定，目的片段和载体的摩尔比多少为好。每次连接时是不是都要测两者的浓度，根据公式再计算出两者的用量。连接时有什么需要注意的。我用T4连接酶。
3、构建质粒有一系列的工作，各位在各个步骤中有什么特别需注意的。
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1楼 2012-03-03 11:50:49
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j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wcx蜗牛(金币+1): 2012-03-04 11:17:55
酶切位点单一，末端不要互补了
目的片段：载体=3：1-10：1
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
2楼2012-03-03 15:23:37
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jiaxinfish

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wcx蜗牛(金币+1): ★有帮助 2012-03-04 11:18:13
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-04 15:37:29
1 按照你用的内切酶的说明书来设置体系，/环状载体也好切
2 载体/片段 以1：3～1：10为优
3 按部就班，别怕出差，胆大，心细，脸皮厚---》出了问题问老师/师兄/姐
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3楼2012-03-03 17:31:42
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助，很热心哦 2012-03-04 15:37:55
wcx蜗牛(金币+3): ★★★很有帮助 2012-03-07 09:54:27
1.酶切体系，你可以参照限制性内切酶的说明书，我一般都是载体30ul, 两种酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性内切酶可能buffer也不一样。我都是环状质粒切的，效果还不错。我是设计带有限制性内切酶位点的引物去扩增目的基因，然后把这个基因连接到T载体上，然后再酶切的。
2 目的片段和载体的连接中比例大约为3/1左右。
3 构建质粒时最重要的是要保证你的感受态是OK的，两种质粒酶切3-6小时候，直接去跑胶，回收，立即连接。放置4度冰箱过夜，第二天下午转化，涂板。
这个板的筛选压力设置得小点，挑斑时多挑一些。
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4楼2012-03-04 14:12:39
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wcx蜗牛

无虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-03-04 14:12:39:
1.酶切体系，你可以参照限制性内切酶的说明书，我一般都是载体30ul, 两种酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性内切酶可能buffer也不一样。我都是环状质粒切的，效果还不错。我是设计带有限制性内切 ...

谢谢你的回复，你目的基因连接到T载体上是用的是Taq酶。在转化时发现质粒能够转化进去，可是挑单克隆提出质粒时量很小。再一个转化很容易出现假阳性，请问你平时是怎么避免的，谢谢！
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5楼2012-03-07 09:57:33
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冰凝东

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！欢迎常来交流！ 2012-03-07 12:22:15
一般用加酶切位点的引物PCR扩增目的基因，然后连接到T载体上进行双酶切，就像你另一个问题一样，连接之后转化涂板，挑单克隆摇菌，进行菌液PCR之后大摇再提取质粒，否则有可能所提质粒是原始T载体，是没有连接上目的基因的假阳性，以致切不开。
连接体系在酶的说明书上有的，你看一下，我最近也在构建载体，一般不会关注质粒载体的浓度，于T载体连接相对来说比较容易的。
还有T载体一般都可以用蓝白斑筛选的。。避免假阳性。。
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6楼2012-03-07 10:43:14
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-03-04 14:12:39:
1.酶切体系，你可以参照限制性内切酶的说明书，我一般都是载体30ul, 两种酶各1ul, buffer 5ul, 加水至50ul.注意：不同的限制性内切酶可能buffer也不一样。我都是环状质粒切的，效果还不错。我是设计带有限制性内切 ...

基本上我挑的斑假阳性还是比较少的，比如说我们实验室氨苄、卡那都是用50ug/ml的，如果你想尽量提高你的转化率，那么就买takara的感受态，分装。每10ul加1-2ul的连接产物转化，挑斑检测后确认无误，就进行扩大培养，抽质粒。
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7楼2012-03-07 13:33:53
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西子泪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 鼓励应助，很热心哦 2012-03-08 08:28:28
wcx蜗牛: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-03-26 08:39:22
gs目的基因与p PIC9K质粒载体双酶切
EcoRI和NotI双酶切长度1400左右的目的基因体系：
10×H Buffer  2 μl
  0.1% BSA  2 μl
  0.1% TritonX-100  2 μl  
  EcoRI和NotI
DNA                         ≤1 μg
  灭菌水                 up to 20 μl

双切pic9K质粒
10×H Buffer  2 μl
  0.1% BSA  2 μl
  0.1% TritonX-100  2 μl  
  EcoRI和NotI
质粒                         ≤1 μg
  灭菌水                 up to 20 μl
37℃ 1hr  （宝生物）
酶切后取电泳检测，并浓缩回收

2. T4连接酶连反应
10×T4 DNA Ligase Buffer     2.5  μl
DNA 片段                 约 0.3 pmol
载体 DNA              约 0.03 pmol
T4 DNA Ligase               1 μl
dH2O  up to               25 μl
16℃过夜反应
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8楼2012-03-07 18:49:32
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西子泪

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这是我做时候的基本步骤，希望对你有用
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9楼2012-03-07 18:50:17
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