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keennes

木虫 (著名写手)

[交流] 研究细胞信号转导通路,建立细胞系,是否一定要敲出细胞内源性蛋白分子? 已有2人参与

本人从事细胞内信号转导途径的研究,需要建立一个新细胞系,用EGFP标记某一蛋白分子,以监测该蛋白涉及到的信号途径的信号传递情况。我的建议是:敲出细胞内源性的该蛋白,通过表达构建载体在细胞表达EGFP与该蛋白的融合蛋白,达到精确定量测定信号强弱的目的。但是导师和其他人不同意,认为没有必要。我也就按照他们的意见来做,但我给导师明确说了保留我的意见。后来出了问题,信号果然很弱;增加几倍的激动剂,仍然很弱。但他们仍然认为敲出内源性蛋白没有必要。我很迷茫啊,请牛人给个建议。谢谢了先。

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chenliang_0513

铁杆木虫 (职业作家)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
如果测信号的强弱,不是一般测荧光双报告基因吗?
如果要做蛋白质的相互作用结合力,就用BICO-3000测亲和力常数?
具体你的实验是要干嘛我也不清楚,单是我做了不是siRNA的实验,还有双报告的实验,一般都是差距不明显的,所以你敲内源的没有意义
我本将心向明月,奈何明月照沟渠?
6楼2012-02-29 18:12:13
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320080920001

金虫 (正式写手)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
可以先检测一下内源蛋白的表达量的水平吧 如果太高的话就得考虑做knock-out了
2楼2012-02-28 16:51:17
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keennes

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 320080920001 at 2012-02-28 16:51:17:
可以先检测一下内源蛋白的表达量的水平吧 如果太高的话就得考虑做knock-out了

谢谢你。我也说过,把目前有的普通细胞,比如3t3,cho,cho-k1,u2os等做一个内源性蛋白RNA的QPCR,但是方案被否了。现在已经被停实验了,要求查文献,寻找更可行的办法。我真的很无奈……
独上高楼,望尽天涯路……
3楼2012-02-29 10:09:26
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chenliang_0513

铁杆木虫 (职业作家)

★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
本来就没有必要嘛,如果LZ看到那篇英文文献有报道请告知俺
我本将心向明月,奈何明月照沟渠?
4楼2012-02-29 17:01:05
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