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ywxkjjh

金虫 (初入文坛)

[求助] PITC衍生化测定氨基酸

用PITC衍生化测定甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量
测定步骤:
1. 用纯水配制甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合液,其浓度都大约为0.05mg/mL,得到甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的混合标准溶液。
2. 配制1.2%PITC乙腈溶液和14%TEA乙腈溶液。
3. 衍生化过程:取200uL氨基酸混合标准溶液于1.5mL离心管中,然后加入100uL1.2%PITC乙腈溶液和100uL14%TEA乙腈溶液,摇震使其混合均匀,然后于水浴锅中水浴加热1小时,然后加入500uL正己烷萃取两次,最后取下层液200uL于HPLC瓶中,然后再加入400uL水稀释,用HPLC分析。

色谱条件:
柱子:Agilent SB-Aq 250mm*4.6mm, 5um
流动相A:50mM NaAC (pH=6.5)
流动相B:50mM NaAC (pH=6.5):ACN=1:1
Time:0-10-25-40min
B%:5%-5%-95%-95%
进样量10uL

出现问题:
1. 甘氨酸和谷氨酰胺衍生化峰会分叉。
2. 会出现很多杂峰,尤其是在强洗脱部分。

请有经验的虫友们多多帮助我!谢谢!
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金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
是标准品还是样品出现了这两种情况啊?如果是样品的话,属于正常现象,如果是标准品可能是柱子曾用于其他样品的分析或使用时间过长。
2楼2012-01-31 17:49:52
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louveffy

新虫 (初入文坛)

你好 请问你水浴温度是多少啊

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-07-10 12:42:12
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