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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 医学 » 基础 » 从骨髓中分离造血干细胞
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)

[求助] 从骨髓中分离造血干细胞

小虫想从大鼠股骨的骨髓中分离出造血干细胞（或者有核细胞），进行RT-PCR。但不知道应该怎样分离？愁死我了……希望大家给点建议啊~~谢谢了！！！
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1楼2012-01-06 20:11:34
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ht_235

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用Ficoll液，密度梯度离心就可以了。吸取中间的白膜层，就是单个核细胞。如果只要造血干，就需要流式分选CD34细胞了，或者免疫磁珠分选，也是可以的。
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2楼2012-01-06 22:41:05
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ht_235 at 2012-01-06 22:41:05:
用Ficoll液，密度梯度离心就可以了。吸取中间的白膜层，就是单个核细胞。如果只要造血干，就需要流式分选CD34细胞了，或者免疫磁珠分选，也是可以的。

谢谢您~我查资料看到，Ficoll液适用于分离单核细胞啊，不知道可不可以分离单个核细胞？谢谢啦~还有Percoll液是否也可以呢？
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3楼2012-01-07 13:06:46
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ht_235

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
老实人sdu3375(金币+5): 2012-03-10 14:11:09
ficoll分离的是单个核细胞，不是单核细胞。单核细胞也得流式分选CD14或者CD68阳性的才行，哪有那么简单分离单核细胞的方法啊。
ficoll和percoll都是可以的。
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4楼2012-01-08 08:47:17
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ht_235 at 2012-01-08 08:47:17:
ficoll分离的是单个核细胞，不是单核细胞。单核细胞也得流式分选CD14或者CD68阳性的才行，哪有那么简单分离单核细胞的方法啊。
ficoll和percoll都是可以的。

是啊~小弟刚上研一，而且做的课题跟自己专业不太相关，没大有头绪~谢谢了~~那么ficoll和percoll这两种细胞分离液得需要哪种密度的呢？您看得从哪儿查呢?谢谢~
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5楼2012-01-08 13:23:24
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ht_235

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

老实人sdu3375(金币+10): ★★★很有帮助 2012-01-08 20:33:46
1.077的就可以了……
这是我的专业问题
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6楼2012-01-08 14:54:57
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ht_235 at 2012-01-08 14:54:57:
1.077的就可以了……
这是我的专业问题

谢谢~~这个数值是怎么得来的呢？
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7楼2012-01-08 20:33:32
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ht_235 at 2012-01-08 14:54:57:
1.077的就可以了……
这是我的专业问题

我感觉我大鼠的骨髓中有些块状的东西，且较致密……不知道是什么？您看我这样进行操作行否？
1、用生理盐水将骨髓冲到离心管中，进行离心。3000r/min,10min.收集细胞，弃上清。
2、将收集的细胞用约2ml生理盐水重悬，而后小心加到1.077约12ml的ficoll液中。
3、用带有水平转子的离心机进行离心，1500r/min,20min.
4、收集中间白色的细胞即为单个核细胞。
想向您请教一下：我的这个转速和时间可以吗？因为我的样品有限，不敢再用来做预实验了……谢谢您了！
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8楼2012-01-08 20:45:39
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ht_235

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 老实人sdu3375 at 2012-01-08 20:45:39:
我感觉我大鼠的骨髓中有些块状的东西，且较致密……不知道是什么？您看我这样进行操作行否？
1、用生理盐水将骨髓冲到离心管中，进行离心。3000r/min,10min.收集细胞，弃上清。
2、将收集的细胞用约2ml生理盐水 ...

这个转数，不同离心机有所不同，一般是400g的离心力，离心30min。你可以自己换算一下转数
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9楼2012-01-10 07:46:23
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老实人sdu3375

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by ht_235 at 2012-01-10 07:46:23:
这个转数，不同离心机有所不同，一般是400g的离心力，离心30min。你可以自己换算一下转数

您说的这个600g指的是密度梯度离心时的转速吗？那我收集细胞的转速和时间怎么样呢？谢谢了~~
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10楼2012-01-10 13:47:20
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