| 查看: 519 | 回复: 0 | ||
[求助]
粘性末端克隆无目的片段
|
|
BamH1酶切得到目的片段约为100bp，胶回收；puc19载体经过BamH1单酶切，去磷酸化处理，胶回收；然后连接转化，蓝白斑筛选，取阳性克隆鉴定！ 1.M13pcr P不出目的条带； 2.提取质粒酶切也切不出目的片段； 可是为什么会有那么多白斑呢？哎，哪一步最可能出现问题呀，谢谢大家！ ps简单的步骤 1.提取puc19，Bamh1酶切，去磷酸化，胶回收 2.克隆提取质粒，酶切，胶回收 3连接反应 片段，载体按么人比1/10混合，65度5min，冰浴3min，加入buffer，T4酶，连接16h、16度 4转化 正常转化 可能的问题（自己想到的）： 1.第一步提取PUC19时忘了加AMP，有杂菌？可是提出质粒大小合适呀？ 2.由于载体酶切之后要胶回收，所以切了20ug，难道直接没有切开，跑电泳检测的时候，切过和没切过的有差别的，不过差别不是很大？ 3.最后检测的时候由于片段太小，载体太大，电泳检测不出来？ 4.M13引物不是一个公司的？不太可能，我M13引物在puc19全序列比对过，酶切位点在二者之间 5.PUC19是T载体中阳性对照的puc19DNA，重新转化养起来提的质粒，做载体用的，难道是这一步有问题，不知道当时怎么想的，突然就这样做了，哎！ 谢谢大家了哈！  |
回复此楼» 猜你喜欢
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有101人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有17人回复
-
散金
已经有37人回复
找到一些相关的精华帖子，希望有用哦~
高保真酶PCR产物连接pMD-19T载体，DH5a感受态，怎么总是连接不上
已经有26人回复
- DNA的连接反应
已经有5人回复
- PCR ， 双酶切，连接问题
已经有17人回复
- X—Gal IPTG蓝白斑试验
已经有8人回复
- 【求助/交流】【求助】细菌未知功能基因的克隆方法
已经有14人回复
- 谁做过adaptor 衔接子
已经有6人回复
- 微生物学考研资料1(沈萍版同步）免币分享
已经有67人回复
点击这里搜索更多相关资源科研从小木虫开始，人人为我，我为人人
