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梦寒南开

新虫 (初入文坛)

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虫号: 1350370
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专业: 植物资源学

[求助] 粘性末端克隆无目的片段

BamH1酶切得到目的片段约为100bp，胶回收；puc19载体经过BamH1单酶切，去磷酸化处理，胶回收；然后连接转化，蓝白斑筛选，取阳性克隆鉴定！
1.M13pcr P不出目的条带；
2.提取质粒酶切也切不出目的片段；
可是为什么会有那么多白斑呢？哎，哪一步最可能出现问题呀，谢谢大家！
ps简单的步骤
1.提取puc19，Bamh1酶切，去磷酸化，胶回收
2.克隆提取质粒，酶切，胶回收
3连接反应片段，载体按么人比1/10混合，65度5min，冰浴3min，加入buffer，T4酶，连接16h、16度
4转化正常转化
可能的问题（自己想到的）：
1.第一步提取PUC19时忘了加AMP，有杂菌？可是提出质粒大小合适呀？
2.由于载体酶切之后要胶回收，所以切了20ug，难道直接没有切开，跑电泳检测的时候，切过和没切过的有差别的，不过差别不是很大？
3.最后检测的时候由于片段太小，载体太大，电泳检测不出来？
4.M13引物不是一个公司的？不太可能，我M13引物在puc19全序列比对过，酶切位点在二者之间
5.PUC19是T载体中阳性对照的puc19DNA，重新转化养起来提的质粒，做载体用的，难道是这一步有问题，不知道当时怎么想的，突然就这样做了，哎！
谢谢大家了哈！