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郝连芷水

木虫 (小有名气)

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[求助] 酶切酶连转化

各位，请教个问题。
我需要重组构建个质粒，要将A质粒的7kb片段PCR出来（KOD酶），B质粒的1.7kb片段PCR出来（Pfu酶），然后再进行双酶切，酶连，转化（没有好的酶切位点，只有P出来）。
现在遇到的问题是P出来的非特异带很多，目的带回收后浓度非常低15ng/µl（100µl体系），而且目的条带有时有有时没有。然后我还要酶切，再回收，几乎就没有了，然后转感受态，做了n批，都没有阳性克隆，不知道问题出在哪里。求教如何改善？

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1楼 2011-12-25 20:42:23

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erlangshen89

木虫 (小有名气)

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引用回帖:

6楼: Originally posted by yuandian114 at 2011-12-26 13:48:15
切胶回收，将胶回收的PCR产物直接作为模板再做PCR，不过能这里头有个小技巧lz可以参考一下，就是讲退火温度提高，这个经过我自己验证了N次，绝对可以减少非特异性条带，哈哈，希望对lz有帮助，也希望lz实验顺利

请问是将胶回收的目的PCR片段做模板再进行PCR吗？我试过将融合出来的片段做模板，没有扩增出条带，再者就是将退火温度提高，一般提高到多少度？用两步法合适吗？
谢谢啦期待回复