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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 借助于ADH酶来测PDC酶活性相关问题
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minting12

新虫 (初入文坛)

[求助] 借助于ADH酶来测PDC酶活性相关问题

有没有人测过PDC(丙酮酸羧化酶)的活性，PDC酶能够催化丙酮酸生成乙醛，乙醛能在ADH（乙醇脱氢酶）的作用下生成乙醇，这个途径中NADH转化成NAD，不过ADH是个双向酶，它也能催化乙醇生成乙醛，这个方向NAD转化成NADH。我测PDC活性就是通过在反应体系（MES缓冲液，丙酮酸，NADH，ADH）中加入酶液，看NADH在340下的减少定义PDC的活性，可是在我实验过程中遇到个问题，有些样品加入酶液后NADH没减少反而上升，或者是先上升后下降，这个问题我应该怎么解决，求高手，求解答，谢谢~~
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1楼 2011-12-15 11:29:15
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qaz20021

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天(金币+3): 鼓励分享 交流 2011-12-21 12:38:32
尝试回答一下：
（1）你所测的PDC样品应该不是纯的吧？这样的话，一定要注意PDC样品量要少，占最终反应体系的比例在2%或以下，NAD/NADH可以作为很多酶的底物，你的样品就有可能含有这些干扰酶，减少样品量有助于减少干扰。
（2）ADH酶要过量，比你样品PDC的活性要高出很多才行；
（3）丙酮酸底物要过量，NADH要适量（注意初始吸光度在1.5左右最好）。
（4）检测时间要短，超过5min（或更短时间）后的数据就没有意义了。
以前做过相关的，暂时只记得这些，希望对你有所帮助。
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2楼2011-12-16 13:21:25
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minting12

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by qaz20021 at 2011-12-16 13:21:25:
尝试回答一下：
（1）你所测的PDC样品应该不是纯的吧？这样的话，一定要注意PDC样品量要少，占最终反应体系的比例在2%或以下，NAD/NADH可以作为很多酶的底物，你的样品就有可能含有这些干扰酶，减少样品量有助于 ...

非常感谢。
    我的PDC样品是粗提物，没经过纯化的，按文献里报道的，我的反应样品与反应体系比例：1：10，按你这么说，我这个比例可能大了。我有尝试增大丙酮酸的浓度，不过丙酮酸在340下有吸光值，太大了会有影响。文献里有报道PDC在25℃下活性最高，那我想问一下，你当时温度是怎么控制的呀，我之前直接从冰上拿出来，然后在室温下测的，现在天冷，温度低，估计不准吧~~
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3楼2011-12-19 14:59:10
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qaz20021

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
看天(金币+2): 鼓励 2011-12-21 12:38:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by minting12 at 2011-12-19 14:59:10:
非常感谢。
    我的PDC样品是粗提物，没经过纯化的，按文献里报道的，我的反应样品与反应体系比例：1：10，按你这么说，我这个比例可能大了。我有尝试增大丙酮酸的浓度，不过丙酮酸在340下有吸光值，太大了会有 ...

这个温度很重要的啦，我以前用的类似医院的生化仪，检测系统内是恒温的。
那你就想办法把创造出一个恒温的条件，要不测出来的肯定不准，最好可以用好一点的带温控读数仪，酶标仪什么的。
我读书的时候有同学在冬天重复我的SOD活性实验总不成功，最后发现就是温控的问题。
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4楼2011-12-19 15:33:16
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minting12

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by qaz20021 at 2011-12-19 15:33:16:
这个温度很重要的啦，我以前用的类似医院的生化仪，检测系统内是恒温的。
那你就想办法把创造出一个恒温的条件，要不测出来的肯定不准，最好可以用好一点的带温控读数仪，酶标仪什么的。
我读书的时候有同学在 ...

好的，谢谢啦~我现在改用酶标仪测了
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5楼2011-12-30 11:21:23
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minting12

新虫 (初入文坛)
???????:
5?: Originally posted by minting12 at 2011-12-30 11:21:23:
????лл??~?????????????????

你好，之??用酶标仪???的??好，现在?????新开始???PDC的酶活了，???现个问题，在??加酶液的时候???光值也有???化，这个应该怎么解决呢
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6楼2012-03-29 16:33:45
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