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daodao8657

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[求助] 等点聚焦电泳染色与脱色

在跑了等点聚焦电泳后，用考马斯亮蓝染液染色30min后，用脱色液脱色4天后还是不能脱色，请问是什么原因？对染色液和脱色液有什么要求吗？样品是已纯化的蛋白，为了测定等电点
试验中用的是bio-rad pH3-10的预制胶条，考马斯亮蓝染色液配方是：R-250 1g，甲醇 450ml，冰醋酸 100ml，蒸馏水 450ml。脱色液配方：甲醇 200ml，冰醋酸 200ml，蒸馏水 1600ml

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1楼 2011-12-13 21:09:58

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zzq770204

至尊木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
daodao8657(金币+5): 很有帮助，谢谢 2011-12-14 17:02:13

你得方法应该是考马斯亮蓝法，目前常用的有如下2个，给你参考下
经典的考马斯亮兰染色程序：
1 固定 20 % TCA 1h
2 染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h
3 脱色 40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min
4 强化 1% acetic acid overnight
5 清洗 deionized H2O 30 min
局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot）

Neuhoff 胶体考马斯亮兰染色
染色液成分：100 mL H2O和100 mL H3PO4 以及100 g粉末状(NH4)2SO4先溶解，然后加入1.2 g G-250再溶解，用水定容到800 mL，搅拌后加入200 mL甲醇，具体步骤如下：
1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA） 2h
2 染色：200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h
3 漂洗：
1）0.1 mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟；
2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min
4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。
优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot.

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2楼2011-12-14 14:43:27

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daodao8657

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引用回帖:

楼: Originally posted by zzq770204 at 2011-12-14 14:43:27:
你得方法应该是考马斯亮蓝法，目前常用的有如下2个，给你参考下
经典的考马斯亮兰染色程序：
1 固定 20 % TCA 1h
2 染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h
3 脱色 40% EtOH&10% acetic acid 2 ...

请问用过Neuhoff法吗？背景低是什么意思？是指背景不会被染得很严重吗？谢谢！

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3楼2011-12-14 17:00:47

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