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daodao8657金虫 (小有名气)
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[求助]
等点聚焦电泳染色与脱色
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在跑了等点聚焦电泳后，用考马斯亮蓝染液染色30min后，用脱色液脱色4天后还是不能脱色，请问是什么原因？对染色液和脱色液有什么要求吗？样品是已纯化的蛋白，为了测定等电点 试验中用的是bio-rad pH3-10的预制胶条，考马斯亮蓝染色液配方是：R-250 1g，甲醇 450ml，冰醋酸 100ml，蒸馏水 450ml。脱色液配方：甲醇 200ml，冰醋酸 200ml，蒸馏水 1600ml |
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
daodao8657(金币+5): 很有帮助，谢谢 2011-12-14 17:02:13
daodao8657(金币+5): 很有帮助，谢谢 2011-12-14 17:02:13
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你得方法应该是考马斯亮蓝法，目前常用的有如下2个，给你参考下 经典的考马斯亮兰染色程序： 1 固定 20 % TCA 1h 2 染色 0.1% CBB in 40% EtOH/10% acetic acid 2h 3 脱色 40% EtOH&10% acetic acid 2x 30 min 4 强化 1% acetic acid overnight 5 清洗 deionized H2O 30 min 局限：灵敏度低（≈1μg protein/spot） Neuhoff 胶体考马斯亮兰染色 染色液成分：100 mL H2O和100 mL H3PO4 以及100 g粉末状(NH4)2SO4先溶解，然后加入1.2 g G-250再溶解，用水定容到800 mL，搅拌后加入200 mL甲醇，具体步骤如下： 1 固定：12％（w/v）三氯醋酸（TCA） 2h 2 染色：200ml染色液混合50ml甲醇 16-24h 3 漂洗： 1）0.1 mol/L Tris-H3PO4缓冲液（pH 6.5）漂洗两分钟； 2）25％（v/v）甲醇漂洗不超过1min 4 稳定：在20％的(NH4)2SO4中稳定蛋白质－染料复合物。 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot. |
2楼2011-12-14 14:43:27
daodao8657
金虫 (小有名气)
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- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2011-12-14 17:00:47
4楼2011-12-14 19:16:08
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