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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求救啊！请高手诊断病因所在，关乎实验生死.（免疫荧光技术）
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shwkx1987

新虫 (小有名气)

[求助] 求救啊！请高手诊断病因所在，关乎实验生死.（免疫荧光技术）

各位姐妹、兄弟：
       小弟这学期做免疫荧光，到现在了一直做不出漂亮的片子，实在没招了，快急死了。现在向各位求救。我把我的过程和结果附上（染中等纤维），还请各位赐教啊。
实验步骤：
1、用pH8.0的PBS浸泡细胞爬片，5min/3次
2、用预冷的甲醇，在-20度固定10min
3、用pH8.0的PBS浸泡细胞爬片，5min/3次
4、室温封闭1h。封闭液：0.5%山羊血清、0.3%tritonX-100
5、加一抗，4度过夜
6、用pH8.0的PBS浸泡细胞爬片，5min/3次
7、暗处加二抗，染色2h
抗体稀释液：pbs、0.1%BSA、0.3%tritonX-100.
所有用的试剂配方都是按抗体说明书配置





[ Last edited by amisking on 2011-12-2 at 19:47 ]
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1楼 2011-12-02 18:22:06
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
yqbter: 金币+3, 感谢分享！ 2012-05-30 08:12:51
我最近也在做免疫荧光，感觉你的方法比我的少了几步。
1 我用的固定液是4%多聚甲醛，并且固定30分钟后，60度烤片过夜，或6个小时。
2 我还有抗原修复的过程，你可以修复下。
3我是封闭半个小时。
4 二抗我也是半个小时。
5 如果你有条件，最好用DAPI染下细胞核。更容易观察。
6 你用什么封片？最好用配制的缓冲液封片，否则易淬灭。

希望对楼主有帮助。
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2楼2011-12-02 21:30:33
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2011-12-02 21:30:33:
我最近也在做免疫荧光，感觉你的方法比我的少了几步。
1 我用的固定液是4%多聚甲醛，并且固定30分钟后，60度烤片过夜，或6个小时。
2 我还有抗原修复的过程，你可以修复下。
3我是封闭半个小时。
4 二抗我也是 ...

谢谢你的回复。你是做的细胞爬片还是组织切片啊，60度烤片，那不会干了吗？至于抗原修复我也查了有些资料是有这样的做法，它在组织切片中庸的较多，细胞爬片较少。而且抗体说明书中也没有这一步。还请指教
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3楼2011-12-03 13:43:26
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

shwkx1987(金币+1): 2011-12-06 18:16:27
引用回帖:
3楼: Originally posted by shwkx1987 at 2011-12-03 13:43:26:
谢谢你的回复。你是做的细胞爬片还是组织切片啊，60度烤片，那不会干了吗？至于抗原修复我也查了有些资料是有这样的做法，它在组织切片中庸的较多，细胞爬片较少。而且抗体说明书中也没有这一步。还请指教

我做的是细胞爬片，抗原修复是因为在固定时，可能由于蛋白相互作用而封闭了抗原决定簇，有些抗原决定簇在外面，是不用修复的，有些不修复就做不出结果。跟切片和爬片关系不大。
60度烤片主要是防脱片，如果细胞不掉片，不用烤的。烤片后还要水化的。
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4楼2011-12-03 15:57:32
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kaobo2012 at 2011-12-03 15:57:32:
我做的是细胞爬片，抗原修复是因为在固定时，可能由于蛋白相互作用而封闭了抗原决定簇，有些抗原决定簇在外面，是不用修复的，有些不修复就做不出结果。跟切片和爬片关系不大。
60度烤片主要是防脱片，如果细胞 ...

谢谢你。
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5楼2011-12-06 18:17:14
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shwkx1987

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kaobo2012 at 2011-12-03 15:57:32
我做的是细胞爬片，抗原修复是因为在固定时，可能由于蛋白相互作用而封闭了抗原决定簇，有些抗原决定簇在外面，是不用修复的，有些不修复就做不出结果。跟切片和爬片关系不大。
60度烤片主要是防脱片，如果细胞不 ...

你修复的这一步是怎么做的啊？我最近的实验用甲醇不能固定了，用甲醛固定的时候抗体反应太差，我也想修复抗原
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6楼2012-05-29 21:41:27
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kaobo2012

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
telomerase: 金币+3, 辛苦了，欢迎多多交流 2012-05-30 09:26:59
引用回帖:
6楼: Originally posted by shwkx1987 at 2012-05-29 21:41:27
你修复的这一步是怎么做的啊？我最近的实验用甲醇不能固定了，用甲醛固定的时候抗体反应太差，我也想修复抗原...

胰酶10分钟。你可以用冷丙酮固定。也是不用Triton处理的。
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7楼2012-05-29 22:34:18
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mercutio

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

楼主好，请问一般蛋白质的抗原决定基怎么查找呢？比如溶菌酶，卵清蛋白什么的
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8楼2012-09-09 16:18:18
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