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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 请教研究农杆菌的虫友
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xn712100

银虫 (正式写手)

[求助] 请教研究农杆菌的虫友

我现在在做农杆菌介导的遗传转化，总觉得转化效率太低。我想试着去调整农杆菌的状态和浓度。但是，我不知道怎么去确定我所培养的农杆菌处于指数生长期，想请教有经验的虫友。还有农杆菌侵染的最佳时期真的是指数生长时期吗？怎么处理培养好的菌液，收集的菌体要怎样处理才能更好的保持它的侵染活性？
如果有相关的文献的话，也请虫友能分享一下。
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1楼 2011-11-19 16:37:20
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lgqcc

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xn712100(金币+10): 非常感谢！ 2011-11-29 14:24:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by 玛格丽特1985 at 2011-11-28 23:02:24:
我用的是农杆菌菌株GV3101，OD值0.4-0.6之间时长的很快，但是不知道什么时候侵染最好，希望得到帮助！

仔细看了下，您是做遗传育种的...大约是做植物农杆菌转化的吧。我只做过真菌的，可能差异比较大。

我们的做法是LB培养农杆菌48小时，之后离心，弃上清，转移至诱导培养基（IM）重悬，在IM中的初始OD为0.2-0.3，然后28°，120rpm 培养，大约6-8h，OD值到0.8-1.0，然后与真菌孢子共孵育...

我们确定菌株状态的依据，就是看它在IM中的生长状态，如果8h还没能从0.3长到0.8左右，那么说明这批农杆菌的状态不佳，基本就是要放弃的。

至于如何保证菌株的活力，我真说不好。对我们而言，就是注意离心的转速不能太高、室温操作，重悬时轻柔些。还有，尽量用活化好的农杆菌，在LB中的培养时间也不应太长....

补充一点,AS是添加到IM里的，在预孵育时就加。

还有一点，农杆菌不是万能的，真的有很多宿主是转不进去，或者效率很低的。也有些宿主是比较容易的...
我们以前就用那种特别好转化的宿主，作为阳性对照，检测这批试验的质量。
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6楼2011-11-29 11:03:11
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hanmao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

xn712100(金币+5): 谢谢！我现在转化的是马铃薯。你是指侵染时的ＯＤ值吗？我需要先把农杆菌培养到一定时期，收集菌体用液体ＭＳ悬浮后，再以０.５－１.０的ＯＤ值进行侵染，但是效果不是很好。 2011-11-29 08:38:26
这要看你的菌株类型，文献上写的也不是很统一。
农杆菌菌株GV3101一般我们选用OD600为0.8时进行侵染，你转化受体是哪种植物啊
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嘎嘎
2楼2011-11-28 09:07:16
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玛格丽特1985

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
zhang8826857(金币+5): 鼓励新虫 2011-11-29 08:48:46
我用的是农杆菌菌株GV3101，OD值0.4-0.6之间时长的很快，但是不知道什么时候侵染最好，希望得到帮助！
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3楼2011-11-28 23:02:24
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lgqcc

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
zhang8826857(金币+1): 鼓励交流 2011-11-29 08:49:00
xn712100(金币+5): 谢谢！您说的这三种菌株我都有做过，个人觉得ＥＨＡ１０５要好一点。您所说的梯度实验，我也做过但是效果不明显。对遗传转化来说，实验周期太长。个人觉得转化时菌株的状态比较重要，想知道怎么判断菌株的活力水平，以及收集菌体后如何保持它的活力状态。希望您不惜赐教！ 2011-11-29 10:05:54
引用回帖:
3楼: Originally posted by 玛格丽特1985 at 2011-11-28 23:02:24:
我用的是农杆菌菌株GV3101，OD值0.4-0.6之间时长的很快，但是不知道什么时候侵染最好，希望得到帮助！

没做过这种的，我用过LBA4404、AGL-1、EHA105，不同菌株的最适合OD值是不一样的，建议从0.6-1.0做一个梯度试验。转化效率和宿主的状态、共孵育条件都有很大关系，祝好运。
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4楼2011-11-29 08:16:27
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