真菌基因组DAN提取图片，求高人指点 - 分子生物 - 存档旧帖

11楼2011-10-18 23:57:57

蓝月望宁

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西瓜(金币+4): Good！ 2011-10-19 18:36:31

我也来说说。
1.你的电泳图，MARker条带跑的很漂亮，可以排除电泳条件方面的原因。
2.点样孔发亮的原因是有机物和蛋白质等杂质，这个不是关键问题。
3.样品DNA条带弥散，几乎布满整个泳道，说明DNA严重降解，这才是问题关键。
个人愚见。所有实验用品灭菌，除去核酸酶，操作过程中在冰上进行，操作过程尽量轻柔。
你提取DNA的方法我没用过，仅仅根据我自己用的方法及应验给你提的建议，仅供参考！

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12楼2011-10-19 09:54:07

doudouxiong

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引用回帖:

12楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2011-10-19 09:54:07:
我也来说说。
1.你的电泳图，MARker条带跑的很漂亮，可以排除电泳条件方面的原因。
2.点样孔发亮的原因是有机物和蛋白质等杂质，这个不是关键问题。
3.样品DNA条带弥散，几乎布满整个泳道，说明DNA严重降解，这 ...

您说的挺对的，因为我的材料量比较少，所以我认为要保证充分的破壁，可是用液氮法研磨时孢子量本来很少，造成显微镜下观察被磨破的孢子量很少，加上倒液氮的时候还有一些孢子飞出去，因此我放弃这种方法。上图提取的DNA是我先用液氮研磨后又加入CTAB研磨，主要是保证少量材料全部破壁，可是由于加入CTAB研磨时间过长，造DNA的降解和蛋白质的污染，可是时间短了又不能破壁，有没有什么既能够破壁充分，有不引入杂质或者造成DNA降解的方法呢？请您帮忙，另外由于老师不建议用试剂盒和较贵的试剂，所以目前只能突破这个破壁又有纯化的DNA的方法了，请问您有没有什么好的建议，话说我的材料量真的少的可怜啊

13楼2011-10-19 18:12:14

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我也是用氯化苄法提总DNA。提总RNA就用液氮+Trizol。用液氮时，研磨操作中间注意补充液氮--可以用铁丝绑个5ml-10ml大小的离心管取液氮出来，直到研磨成粉末，加Trizol。

为什么

14楼2011-10-20 18:23:15

Sarah_Shy

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其实没必要为了破壁就一直研磨。我以前实验室师妹也是提孢子，量很少，她就是在孢子粉中加入适量裂解液，然后适当研磨，接着就按正常步骤提取DNA，提出来的效果挺好的。像你这样DNA基本都降解了

15楼2011-10-21 17:01:56

blastfeng

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我以前提过红曲霉的基因组，多抽两次蛋白，加蛋白酶K，另外，加RNAase，很可能有RNA干扰

生活就像PCR

16楼2011-10-21 21:46:44

Petter_JDW

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1.液氮研磨时候可以加一些石英砂，增加摩擦效果，就可以适当减少研磨时间；
2.尽量在冰上操作，研钵也要事先在-20度或-80度冰箱预冷；
3.可以加一些RNAase，提取过程尽量动作快准轻！
4.你用的染料是EB的话，RNA也会看得很清楚；如果要图好看可以试试Golden View，这个可能对RNA显色不太好；
5.其实，如果提基因组的重点一般是为了下游工作，你可以先做做看；只要可以继续下去没必要纠结于这个，对有的步骤追求完美是没意义的，也是费时耗力的；
祝顺利！！！！！

17楼2011-10-21 22:06:19

蓝月望宁

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13楼: Originally posted by doudouxiong at 2011-10-19 11:12:14:
您说的挺对的，因为我的材料量比较少，所以我认为要保证充分的破壁，可是用液氮法研磨时孢子量本来很少，造成显微镜下观察被磨破的孢子量很少，加上倒液氮的时候还有一些孢子飞出去，因此我放弃这种方法。上图提 ...

你好！
首先，对于材料少的问题我不知道是什么原因？不能增加菌体量吗？培养呢？
其次，没错破壁这一步至关重要，可以尝试化学破壁方法，比如用蜗牛酶，或者尝试超声波破碎？
最后，老师的建议很好，试剂盒提是方便，但是没有手提学到的东西多。加油吧

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18楼2011-10-22 08:50:34