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doudouxiong

铜虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by ybs007 at 2011-10-17 18:25:23:
我以前提过酵母基因组 用氯化苄法   你可以参考参考

谢谢关注
11楼2011-10-18 23:57:57
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good! 2011-10-19 18:36:31
我也来说说。
1.你的电泳图,MARker条带跑的很漂亮,可以排除电泳条件方面的原因。
2.点样孔发亮的原因是有机物和蛋白质等杂质,这个不是关键问题。
3.样品DNA条带弥散,几乎布满整个泳道,说明DNA严重降解,这才是问题关键。
个人愚见。所有实验用品灭菌,除去核酸酶,操作过程中在冰上进行,操作过程尽量轻柔。
你提取DNA的方法我没用过,仅仅根据我自己用的方法及应验给你提的建议,仅供参考!
坚持,一秒钟,就离,成功,近一步!
12楼2011-10-19 09:54:07
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doudouxiong

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by 蓝月望宁 at 2011-10-19 09:54:07:
我也来说说。
1.你的电泳图,MARker条带跑的很漂亮,可以排除电泳条件方面的原因。
2.点样孔发亮的原因是有机物和蛋白质等杂质,这个不是关键问题。
3.样品DNA条带弥散,几乎布满整个泳道,说明DNA严重降解,这 ...

您说的挺对的,因为我的材料量比较少,所以我认为要保证充分的破壁,可是用液氮法研磨时孢子量本来很少,造成显微镜下观察被磨破的孢子量很少,加上倒液氮的时候还有一些孢子飞出去,因此我放弃这种方法。上图提取的DNA是我先用液氮研磨后又加入CTAB研磨,主要是保证少量材料全部破壁,可是由于加入CTAB研磨时间过长,造DNA的降解和蛋白质的污染,可是时间短了又不能破壁,有没有什么既能够破壁充分,有不引入杂质或者造成DNA降解的方法呢?请您帮忙,另外由于老师不建议用试剂盒和较贵的试剂,所以目前只能突破这个破壁又有纯化的DNA的方法了,请问您有没有什么好的建议,话说我的材料量真的少的可怜啊
13楼2011-10-19 18:12:14
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547star

木虫 (著名写手)

我也是用氯化苄法提总DNA。提总RNA就用液氮+Trizol。用液氮时,研磨操作中间注意补充液氮--可以用铁丝绑个5ml-10ml大小的离心管取液氮出来,直到研磨成粉末,加Trizol。
为什么
14楼2011-10-20 18:23:15
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Sarah_Shy

木虫 (小有名气)

其实没必要为了破壁就一直研磨。我以前实验室师妹也是提孢子,量很少,她就是在孢子粉中加入适量裂解液,然后适当研磨,接着就按正常步骤提取DNA,提出来的效果挺好的。像你这样DNA基本都降解了
15楼2011-10-21 17:01:56
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blastfeng

金虫 (小有名气)

我以前提过红曲霉的基因组,多抽两次蛋白,加蛋白酶K,另外,加RNAase,很可能有RNA干扰
生活就像PCR
16楼2011-10-21 21:46:44
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)

1.液氮研磨时候可以加一些石英砂,增加摩擦效果,就可以适当减少研磨时间;
2.尽量在冰上操作,研钵也要事先在-20度或-80度冰箱预冷;
3.可以加一些RNAase,提取过程尽量动作快 准 轻!
4.你用的染料是EB的话,RNA也会看得很清楚;如果要图好看可以试试Golden View,这个可能对RNA显色不太好;
5.其实,如果提基因组的重点一般是为了下游工作,你可以先做做看;只要可以继续下去没必要纠结于这个,对有的步骤追求完美是没意义的,也是费时耗力的;
祝顺利!!!!!
17楼2011-10-21 22:06:19
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蓝月望宁

金虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by doudouxiong at 2011-10-19 11:12:14:
您说的挺对的,因为我的材料量比较少,所以我认为要保证充分的破壁,可是用液氮法研磨时孢子量本来很少,造成显微镜下观察被磨破的孢子量很少,加上倒液氮的时候还有一些孢子飞出去,因此我放弃这种方法。上图提 ...

你好!
首先,对于材料少的问题我不知道是什么原因?不能增加菌体量吗?培养呢?
其次,没错破壁这一步至关重要,可以尝试化学破壁方法,比如用蜗牛酶,或者尝试超声波破碎?
最后,老师的建议很好,试剂盒提是方便,但是没有手提学到的东西多。加油吧
坚持,一秒钟,就离,成功,近一步!
18楼2011-10-22 08:50:34
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xiaohaozi9876

铁虫 (小有名气)

你这个dna完全可以用,跑pcr一点问题没有
Onceinamoment,wethinkoneselfgrowup,oneday,wefinallyfound...
19楼2012-07-19 11:09:16
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sd3824289

木虫 (正式写手)

DNA提取完毕最好测一下OD260/OD280的值,看是不是在1.9-2.1之间!如果小了,说明是RNA污染,大了说明有蛋白质污染,理想状态是在2.0左右!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
20楼2014-01-23 15:14:21
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